Создание модели мыши Зика вирус-индуцированной неврологических расстройств, используя стратегии внутримозговых инъекций: эмбриональные, у новорожденных и взрослых
Summary
Здесь мы описываем метод для создания модели Зика вирус индуцированной микроцефалия в мыши. Этот протокол включает методы для эмбриона, новорожденных и взрослых стадии внутримозговых прививка Зика вируса.
Abstract
Зика вирус (ZIKV) является flavivirus в настоящее время эндемическим в Северной, Центральной и Южной Америке. Сейчас установлено, что ZIKV может вызвать микроцефалия и дополнительные мозга аномалии. Однако механизм, лежащий в основе патогенеза ZIKV в развивающийся мозг остается неясным. Внутримозговых хирургические методы часто используются в неврологии исследований для решения вопросов о развитии нормальных и ненормальных мозга и функции мозга. Этот протокол использует классический хирургических методов и описывает методы, которые позволяют модель ZIKV-связанные неврологических заболеваний человека в нервной системе мыши. Хотя прямые мозга прививка не модели нормальный режим передачи вируса, метод позволяет следователям целевой вопросы, касающиеся последствие после ZIKV инфекции развивающегося мозга. Этот протокол описывает эмбриональных, у новорожденных и взрослых этапов внутрижелудочкового прививки ZIKV. Как только освоил, этот метод может стать простым и воспроизводимый метод, который занимает всего несколько часов, чтобы выполнить.
Introduction
Микроцефалия это состояние в результате развития дефектных мозга характеризуется меньше, чем средний размер головы у новорожденных. Дети с микроцефалия exhibit целый ряд симптомов, которые могут включать задержки развития, захват, умственной инвалидности, потеря слуха, проблемы со зрением и проблемы с движением и баланса, среди прочего, в зависимости от тяжести заболевания и Причина1,2,3. Это условие является многофакторной в природе, с генетическими, инфекционного агента и экологические факторы, связанные с вызывая микроцефалия4,5,6,,78, 9. До 2015-2016 ZIKV вспышки 8 из 10 000 рождений детей были диагностированы с микроцефалия в Соединенных Штатах согласно CDC10. На 1 февраляst 2016 года Всемирная организация здравоохранения объявила Зика вирус общественного здравоохранения чрезвычайная международная озабоченность ввиду тревожного увеличения числа диагнозов микроцефалия, связанные с ZIKV инфекции у матери11, 12. Недавнее исследование от CDC на ZIKV дела в Соединенных Штатах свидетельствует о том, что матери ZIKV инфекции приводит к кратной повышенный риск для ребенка развивать микроцефалия, по сравнению с неинфицированным лицам и 4% ZIKV инфицированных матерей от США привели к дети с микроцефалия11. Скорость связанные микроцефалия врожденных дефектов во время беременности от инфекции ZIKV в Бразилии, как сообщается, повлияли на 17% младенцев в ВИЧ-инфицированных матерей, указав, что повышенного риска может способствовать другие факторы в Латинской Америке 13. в то время как мы знаем, что ZIKV может вызвать микроцефалия и патогенез в нейронных прогениторных клеток (NPC) населения7,8,14, полный патогенез ZIKV в развитии мозга остается труднодостижимой. Важно развивать животных моделей для дальнейшего изучения болезни механизмы, лежащие в основе патологий мозга, связанные с ZIKV инфекцией.
Напрямую изучить воздействие ZIKV на развитие мозга, мы впервые разработана модель мыши, с помощью внутримозговых прививка эмбриональных день 14,5 (E14.5) мозга с ZIKV7. Этот этап был выбран как это считается представителем в конце первого триместра в человеческой беременности14. Щенков может выжить до послеродового день 5 (P5) с этот метод эмбриональных внутримозговых инъекции (~ 1 мкл 1,7 x 106 Культура ткани инфекционный дозы (TCID50/мл)). Эти послеродовой щенков демонстрируют широкий спектр фенотипов, аналогичным образом наблюдается в инфицированных человеческих младенцев, включая увеличение желудочков мозга, нейронные потерю, аксональное разрежения, astrogliosis и микроглии активации12,15. Мозг новорожденного мыши относительно незрелых, сродни стадии развития человеческого мозга в середине беременности16, и развитие мозга мыши включает в себя основные постнатальный компонент. Для изучения более поздней беременности стадии инфекции, также описан метод для послеродовой инфекции. Новорожденных заражены ZIKV на P1 способны выжить до 13 дней после инъекции. Кровь родился взрослой стадии инфекции была описана в мыши ранее17 но требует использования транскрипции регулирования фактор (МАФ) интерферон (ИФН) факторы МАФ-3, -5,-7 Двухместный нокаут штамма. Этот протокол описывает метод прививки ZIKV intraventricularly обойти отключение противовирусное ответ мышиных модели в взрослых. Хотя это обходит мышиных иммунной системы, этот маршрут инъекций непосредственно не подражать типичный маршрут инфекции. Для устранения этого несоответствия непосредственно, экспериментатор можно выполнить внутриутробная инфекция ZIKV вместо внутричерепных маршрут. Принято от предыдущей работы18, мы кратко описали эту технику в этом протоколе эмбриональных инфекции.
Штаммы вируса Зика, Реализовано с помощью этого метода включают мексиканской изолировать MEX1-447,19 и Африканской изолировать MR-766 изолированы в 1947 году20. Зика MEX1-44 был изолирован в штате Чьяпас, Мексика в январе 2016 из зараженных Aedes aegypti комаров. Мы получили этот вирус с разрешения через университет Техаса Медицинское отделение на Галвестон (UTMB). Кроме того серотипа вируса денге 2 (DENV2) был засеян, используя эту технику в исследовании сравнение. DENV2, штамм S16803 (последовательностей GenBank GU289914), был изолирован от пациента выборки из Таиланда в 1974 году и пассированной в клетках С6/36. Вирус был пассированной дважды в клетках Vero Всемирный консультационный центр для новых вирусов и арбовирусов (WRCEVA) до мыши инъекции. Это показывает, что этот метод работает одинаково хорошо для различных штаммов ZIKV и других flaviviruses, которые могут иметь влияние на развитие мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь метод внутримозговых прививки ZIKV стадии эмбриона, новорожденных и взрослых для изучения ZIKV-индуцированных повреждений в развитии мозга. Хотя простой, есть несколько соображений, которые следователи должны принять для обеспечения качества исследования и безопасность …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы признать д-р Абдель Латиф Benraiss в Университете Рочестер для его наставничества и обсуждения соответствующих для обучения взрослых хирургические и новорожденным методов. Авторы также хотел бы признать, д-р Джеймс Lauderdale в UGA для использования его стереотаксического оборудования и обсуждения связанных с настройкой методологии для этой техники и улучшения для исследования ученые колледжа (дуги) фонд для их поддержка и наша поддержка NIH (NINDS гранты & F99NS105187-01 R01NS096176-02, R01NS097231-01).
Materials
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | – | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | – | |
| Mineral Oil | VWR | – | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
References
- Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
- Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).
- Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).
- Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).
- Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
- Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).
- Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105 (1), 7-17 (2001).
- Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
- Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).
- Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575 (2017).
- Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. , (2017).
