어레이 기반 비교 Genomic 교 잡 플랫폼 효율적인 탐지의 복사 번호 유사 빠른 중성자 유도 개자리속 truncatula 돌연변이에 대 한
Summary
이 프로토콜에 복사 번호 유사의 전체 게놈 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (CGH) 분석 수행에 관심이 있는 연구자에 대 한 실험 단계 및 시 약, 장비, 및 분석 도구에 대 한 정보 제공 식물입니다.
Abstract
돌연변이 유전자 기능 연구에 대 한 귀중 한 유전 자원 이다. 돌연변이 컬렉션을 생성 하려면 세 가지 유형의 mutagens 활용할 수 있습니다, T DNA 또는 transposon 등 생물, 에틸 methanesulfonate (EMS), 같은 화학 또는 이온화 방사선 같은 물리를 포함 하 여. 돌연변이 관찰의 유형에 돌연 사용에 따라 다릅니다. 이온화 방사선 유발 돌연변이, 돌연변이 또는 삭제, 복제, 또는 재배치 포함. T-DNA 또는 transposon-기반 mutagenesis는 변환에 취약 종으로 제한, 화학 또는 물리적 mutagenesis 종의 광범위 한 범위에 적용할 수 있습니다. 그러나, 전통적으로 화학 또는 물리적 mutagenesis에서 파생 하는 돌연변이의 특성 지도 기반 복제 방식을, 노동 집중과 시간이 소모 되는 사용 합니다. 자, 우리 감지 하 여 효율적으로 복사 번호 유사 (CNVs) 돌연변이에 빠른 중성자 사격 (FNB) mutagenesis에서 파생 된 특성 고밀도 게놈 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (aCGH) 플랫폼을 적용할 수 있음을 보여합니다 개자리속 truncatula, 콩과 식물 종입니다. 전체 게놈 시퀀스 분석 50000 개 이상의 유전자 나 유전자 모델 M. truncatula에서 보여줍니다. M. truncatula 에서 현재, FNB 유발 돌연변이에서 150000 이상 m 1 라인을 대표 하는 게놈에 있는 유전자의 기능 연구에 대 한 귀중 한 유전 자원에서 파생 됩니다. 여기에 설명 된 aCGH 플랫폼 FNB 유발 돌연변이 M. truncatula에 특성화를 위한 효율적인 도구입니다.
Introduction
콩 (Fabaceae) 콩 (최대 글리신), 알 팔 파 (개자리속 sativa) 등 많은 경제적으로 중요 한 종 가진 꽃 식물의 3 번째로 큰 가족입니다. 콩과 식물 질소 담합 토양 박테리아, 일반적으로 Rhizobia 있는 대기 이질소 호스트 식물에 의해 사용 하기 위해 암모니아로 감소 된다 뿌리 혹을 개발 하 라는 작용할 수 있습니다. 이와 같이, 콩과 식물 작물의 재배는 질소 비료의 작은 입력 요구 하 고 따라서 지속 가능한 농업에 기여. 콩과 식물 작물 생산 나뭇잎과 씨앗 높은 단백질 콘텐츠, 우수한 사료 및 곡물 작물으로 봉사. 그러나, 재배 콩과 식물 종에는 일반적으로 복잡 한 게놈 구조, 성가신 콩과 식물-특정 프로세스에 핵심 역할을 하는 유전자의 기능 연구를 만드는 있다. 개자리속 truncatula 널리 채택 되었습니다 콩과 식물 연구에 대 한 모델 종으로 주로 하기 때문에 (1)는 상대적으로 작은 단일 게놈 크기 (550 ~ Mbp); 2 중 게놈 (2) 식물 유전자 기능 연구; 대 한 안정적으로 변형 될 수 있다 그리고 (3)은 밀접 하 게 관련 된 알 팔 파 (M. sativa로 구나), 사료의 여왕 및 변환 연구에 대 한 다른 많은 경제적으로 중요 한 작물. 최근, 게놈 시퀀스 M. truncatula cv의 Jemalong A17 발표1,2되었습니다. 게놈 주석 50000 개 이상의 예측된 유전자 나 게놈에 있는 유전자 모델을 보여 줍니다. M. truncatula 에 유전자의 대부분의 기능을 확인 하려면 게놈은 어려운 작업입니다. 유전자의 기능 연구를 촉진 하기 위해1 라인의 범위에서 돌연변이의 포괄적인 컬렉션 생성 된 빠른 중성자 사격 (FNB) mutagenesis M. truncatula 이력서에 사용 하 여 Jemalong A173 4. 빠른 중성자, 고 에너지 이온화 돌연 애기5,6, 쌀 (Oryza sativa)7, 토마토 (푸른 풀밭을 포함 하 여 많은 식물 종에 돌연변이 생성에 사용 되었습니다. lycopersicum), 콩 (글리신 soja; 최대 G.)8,9, 보 리 (Hordeum vulgare), 그리고 로터스 나무10. FNB mutagenesis에서 파생 된 변이의 큰 부분 DNA 삭제 메가 기본적인 쌍9,11몇 가지 기본적인 쌍 크기에서 범위는 한다. 많은 표현 형 관련 유전자 성공적으로 되었습니다 식별 및 특징4,12,13,,1415,16, 17 , 18 , 19. 이전, 지도 기반 접근 시간이 소모 하 고 분자 수준에서 특징을 돌연변이의 수를 제한에 의존 FNB 돌연변이에서 기본 유전자의 분자 클로닝. 최근에, 몇 가지 무료 방법을 사본 기반 메서드를 포함 하 여, 게놈 DNA 복사 번호 유사 검색, 및 전체 게놈 시퀀싱, 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (CGH) 기와 고용 촉진 하는 동물과 식물20,21,22,23,,2425을 포함 한 다양 한 유기 체에서 삭제 돌연변이의 특성 26,,2728,29,30,31.
M. truncatula는 전체 게놈 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (CGH)에서 FNB 돌연변이의 특성화를 촉진 하기 위하여 플랫폼 개발 되어과 검증. 동물 시스템에 보고, CGH 배열 기반 플랫폼 M. truncatula FNB 돌연변이에 전체 게놈 수준에서 복사 번호 유사 (CNVs)의 탐지를 허용 한다. 또한, 병 변 PCR에 의해 확인 될 수 있습니다 및 삭제 테두리 시퀀싱에 의해 확인 될 수 있다. 전반적으로, 배열 CGH 플랫폼 M. truncatula FNB 돌연변이에 병 변 식별에 효율적이 고 효과적인 도구입니다. 여기, 배열 CGH 절차 및 PCR 특성화 M. truncatula FNB 돌연변이에 삭제 테두리의 그림은.
다음 프로토콜 복사 번호의 전체 게놈 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (CGH) 분석 수행에 관심이 있는 연구자에 대 한 실험 단계 및 시 약, 장비 및 분석 도구에 대 한 정보 제공 유사 식물에서. 예를 들어, 개자리속 truncatula FN6191 돌연변이 삭제 지역과 후보 유전자 돌연변이 고기와 관련 된 식별 하 사용 되었다. M. truncatula FN6191 돌연변이, 빠른 중성자 사격 유도 삭제 돌연변이 컬렉션32 에서 원래 고립 된 토양 접종 후 하이퍼 nodulation 표현 형을 전시 하는 ( 테이블의 자료참조) 박테리아, 야생 유형 식물 달리 Sihorhizobium meliloti Sm1021
Protocol
Representative Results
Discussion
어레이 기반 CGH 플랫폼 검색 및 빠른 중성자 사격 (FNB)의 특성에 대 한 개발 했습니다-cv. M. truncatula Jemalong A17에에서 돌연변이 유도. 배열 CGH 메서드 유전자 돌연변이 검출에서 사용을 보여 우리는 돌연변이 FN6191 S. meliloti Sm1021와함께 접종 때 야생 유형 식물, 달리 하이퍼 nodulation 형 전시의 aCGH 분석을 수행. 세분화 분석을 위해 세그먼트 로그2 비율의 의미는 세그먼트 내의 프?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품의 자금에서 제공 됩니다 일부 권한을 부여 하 여 NSF 식물 게놈 연구 (IOS-1127155).
Materials
| Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
| SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
| Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
| Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
| Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
| Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
| Laser scanner | Roche | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
| Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |
References
- Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Wang, H., Li, G., Chen, R., da Silva, J. T. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. , 629-639 (2006).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
- Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
- Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
- Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
- Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
- Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
- Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
- Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
- Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
- Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
- Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
- Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
- Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
- Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
- Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
- Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
- Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
- Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
- Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
- Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
- Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
- Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).
- Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
- Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
- Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
- Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
- Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
- Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
- Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
- Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
- Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
- Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
- . Medicago truncatula Mutant Database Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017)
- Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).
