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Genetics

アレイ ・ ベース比較 Genomic 交配用高速中性子誘起ウマゴヤシ分子変異体のコピー数変化の効率的な検出

Published: November 08, 2017
doi:
10.3791/56470
, , , , ,
1Laboratory of Plant Genetics and Development,Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory,University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School,Li Shui University

Summary

このプロトコルは、コピー数変化の全ゲノム配列に基づく比較 genomic の交配 (CGH) 解析を行うに興味を持っている研究者の実験の手順と分析ツール、機器、試薬に関する情報を提供します。植物。

Abstract

変異体は、遺伝子機能研究のための非常に貴重な遺伝資源です。突然変異体のコレクションを生成するため、T-DNA やトランスポゾンなどの生物、メタンスルホン酸エチル (EMS) などの化学物質や電離放射線などの物理など、変異原物質の 3 つのタイプを利用できます。突然変異の観察の種類使用変異原によって異なります。電離放射線誘発突然変異の突然変異には、削除、複製、または再配置が含まれます。T DNA やトランスポゾンを用いた突然変異誘発は変換に影響を受けやすい種に限られているが、化学的または物理的な突然変異は種の広い範囲に適用できます。しかし、伝統的に化学的または物理的な突然変異から派生した突然変異の特性は、マップベースの複製のアプローチ、集中的な時間のかかる労働をあるに依存します。ここでは、効率的に検出し、コピー数変化 (CNVs) 変異株由来の高速中性子照射 (FNB) 突然変異を特徴付ける高密度のゲノム配列に基づく比較 genomic の交配 (aCGH) プラットフォームを適用できることを示すウマゴヤシ分子、マメ科草種。全ゲノム シーケンス解析は、50,000 以上の遺伝子または遺伝子M. 分子モデルがあることを示しています。M. 分子の存在、FNB 誘発突然変異体でゲノムにおける遺伝子機能研究のための非常に貴重な遺伝資源を表す以上 150,000 の M1 線から派生されます。ここで説明した aCGH プラットフォームは、 M. 分子で FNB 誘発突然変異体を特徴付けるための効率的なツールです。

Introduction

マメ科植物 (マメ科)、大豆 (ダイズ) やアルファルファ (アルファルファ) など多くの経済的に重要な種の顕花植物の 3 番目に大きい家族です。マメ科植物は根粒が大気中の窒素をアンモニア用にホスト植物によって減少を開発する根粒菌の総称で、土壌窒素固定細菌と対話できます。など、マメ科作物の栽培は窒素肥料の少しの入力を必要とし、持続可能な農業に貢献。葉と種子と高たんぱく、優秀な牧草と穀物マメ科作物を生成します。ただし、栽培されているマメ科草種は一般的にマメ科特有のプロセスが面倒で重要な役割を果たす遺伝子の機能解析を行う複雑なゲノム構造を持ちます。ウマゴヤシ分子採用されているマメ科植物の研究のためのモデル種として主な理由は (1) がある比較的小さい半数体ゲノムのサイズ (~ 550 Mbp); 二倍体ゲノム(遺伝子機能研究のため 2) 植物を安定して変換できます。(3) はアルファルファ (M. サティバ)、牧草、女王とトランスレーショナル研究の他の多くの経済的に重要な穀物に密接に関連。最近、ゲノム Jemalong A17 M. 分子cv のリリース1,2をされています。ゲノムの注釈は、50,000 以上の予測遺伝子やゲノムの遺伝子モデルがあることを示しています。M. 分子の遺伝子のほとんどの機能を決定するには、ゲノムはやりがいのある仕事です。遺伝子の機能解析を容易にするために以上 150,000 M1行の範囲の突然変異体の包括的なコレクションによって生成された高速中性子照射 (FNB) 突然変異誘発M. 分子cv Jemalong A173 、4。シロイヌナズナ5,6イネ (イネ)7トマト (ナスを含む多くの植物種の突然変異体の生成に高速中性子、高エネルギー イオン化変異原が使用されていますlycopersicum)、大豆 (ツルマメ;ミヤコグサ大麦 (オオムギ)、 G. 最大)8,910.FNB 変異から派生した突然変異の大部分は、メガ塩基対9,11に数塩基対からサイズの範囲を DNA 削除原因です。多くの表現型に関連する遺伝子が正常にされている識別し、特徴付けられる4,12,13,14,15,16,17,18,19. 以前は、地図ベースのアプローチは時間がかかるし、分子レベルで特徴付けられる突然変異体の数を制限に頼って FNB 変異体から根本的な遺伝子の分子クローニングします。最近では、トラン スクリプト ベースのメソッドを含むいくつかの無料のアプローチ、ゲノム DNA コピー数変化検出、配列する全ゲノムの配列に基づく比較 genomic の交配 (CGH) をタイル採用されている容易にするために、動物や植物20,21,22,23,24,25を含む多様な生物の欠失変異株の解析 26,27,28,29,30,31。

FNB M. 分子、全ゲノム配列に基づく比較 genomic の交配 (CGH) 突然変異体の解析を容易にするには、プラットフォームを開発し、検証されています。動物システムで報告は、CGH アレイ ・ ベース プラットフォームはコピー数変化 (CNVs) M. 分子FNB 変異体のゲノム全体レベルでの検出をことができます。さらに、PCR で病変が確認でき、罫線削除は、シーケンスによって識別できます。全体的にみて、アレイ CGH プラットフォーム、 M. 分子FNB 変異体の病変を識別するに効率的かつ効果的なツールです。ここでは、アレイ CGH プロシージャおよび削除ボーダー M. 分子FNB 変異株の PCR 解析を示します。

次のプロトコルは、コピー数の全ゲノム配列に基づく比較 genomic の交配 (CGH) 解析を行うに興味がある人のため実験手順、試薬、装置および分析ツールに関する情報を提供します。植物の変化。例として、ウマゴヤシ分子FN6191 変異体は、削除領域および突然変異体の表現型に関連する候補遺伝子を識別するために使用されました。M. 分子FN6191 変異体は、もともと由来の高速中性子照射誘起削除変異コレクション32 (材料の表を参照)、土と接種後のハイパー根粒形成表現型の展示細菌、 Sihorhizobium 分類Sm1021、野生型植物とは対照的。

Protocol

注: 図 1 アレイ CGH のプロトコルの 5 つの手順を示しています。彼らは、: 1) 工場用資材の準備2) 高品質 DNA サンプルの分離3) ラベリングと DNA サンプルの精製4) ハイブリダイゼーション、洗浄、および全ゲノム配列のスキャン・ 5) CGH データ分析。M. 糸状菌 ゲノム タイリング アレイには、50,000 以上の遺伝子または遺伝子ゲノム (材料の表 を参照) モ…

Representative Results

図 2は、全ゲノムを渡る WT 信号対変異体の正規化 log2比の分布を示しています。CGH のデータの分析はおおよそ明らかになった全体サンヘンプ遺伝子33と他のいくつかを含む, 染色体 4 22 kb 削除注釈遺伝子の FN6191 変異体 (図 2、図 3)。候補削除された領域は、-2.5 (?…

Discussion

アレイ ・ ベース CGH プラットフォームの検出と高速中性子照射 (FNB) の特性を開発した- M. 分子品種 Jemalong A17 の突然変異体の誘発。アレイ CGH 法遺伝子変異の検出の使用を示すためには、aCGH S. 法 Sm1021を接種したときに野生型植物と対照をなしてハイパー根粒形成表現型を表わした FN6191 変異体の解析を行った。セグメント化の分析のため、セグメントはセグメント内プローブは…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品が資金を提供一部助成金 NSF 植物ゲノム研究 (IOS 1127155) から。

Materials

Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M Agilent G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant) In house FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) In house A17
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 320501
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific 1000D
SureTag DNA Labeling Kit Agilent 5190-3400
Random primer Agilent 5190-3399
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-1L
Thermocycler MJ research PTC-200
Centrifuge Labnet international Inc Spectrafuge 24D
Stabilization and Drying Solution Agilent 5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent 5188-5380
Hybridization Chamber gasket slides Agilent G2505
Human Cot-1 DNA Agilent 5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 Agilent 5188-5221
Hybridization Chamber, stainless Agilent G2534A
Hybridization oven Agilent G2545A
Purification Columns Agilent 5190-3391
Laser scanner Roche MS200
NimbleScan 2.6 Roche Nimblegen 5225035001
Signal Map 1.9 Roche Nimblegen Signalmap1.9
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References

  1. Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
  3. Wang, H., Li, G., Chen, R., da Silva, J. T. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. , 629-639 (2006).
  4. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
  5. Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
  6. Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
  7. Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
  8. Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
  9. Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
  10. Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
  11. Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
  12. Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
  13. Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
  14. Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
  15. Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
  16. Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
  17. Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
  18. Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
  19. Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
  20. Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
  21. Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
  22. Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
  23. Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
  24. Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
  25. Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).
  26. Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
  27. Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
  28. Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
  29. Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
  30. Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
  31. Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
  32. Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
  33. Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
  34. Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
  35. Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
  36. . Medicago truncatula Mutant Database Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017)
  37. Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).

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Array-based Comparative Genomic HybridizationCopy Number VariationsFast Neutron-induced MutantsMedicago TruncatulaLegume BiologyNodule DevelopmentDNA ExtractionDNA LabelingDNA Purification

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Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang, H., Li, S., Chen, R. An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants. J. Vis. Exp. (129), e56470, doi:10.3791/56470 (2017).
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