Biofilme oral amostragem para análise de Microbiome em crianças saudáveis

As bactérias são encontradas em todos os locais dentro da cavidade oral^24,25,26. Muitos estudos têm-se centrado sobre o uso de saliva como um meio de amostragem para mapear a colonização oral como isso facilmente pode ser saboreado através de cuspindo^{27,28,29,30,31, 32}. No entanto, biofilme salivar não reflete composição do biofilme subgengival. Assim, o uso de outros métodos de amostragem é crucial para a criação de toda a imagem e evocará novas discussões na pesquisa odontológica. Vários artigos de comparam o uso de Curetas e pontos de papel para amostragem subgengival de indivíduos doentes remover^8,33,34. Ainda nenhum grupo de pesquisa é conhecido por centraram-se sobre a aplicação de dispositivos de amostragem padronizada para diferentes faixas etárias, especialmente para crianças,¹⁹.

Neste vídeo, é apresentada o biofilme oral amostragem de três habitats orais em crianças saudáveis.

Modificações e solução de problemas:

O objetivo do manuscrito enfoca o protocolo clínico para recolha de amostras de biofilme subgengival de crianças saudáveis. O método de escolha refere-se ao som sulci subgengival onde o espaço limitado torna especialmente desafiador de amostragem. Neste vídeo, o método foi aplicado a dentição permanente precoce. Também pode ser aplicado à dentição mista ou madura e para crianças e/ou adultos. Nosso método de amostragem permite modificações como única ou em pool de amostras. Este último pode tornar-se um fator crucial para análises moleculares devido à pequena quantidade de DNA colecionável do sulco subgengival saudável. A escolha dos dentes índice pode ser modificada sob demanda; em particular, outro dente pode ser incluídos na amostra como uma alternativa quando o epitélio é traumatizado e sangrando, tornando o ponto de papel inutilizável. Amostragem paralela usando dois pontos de papel simultaneamente em um local processa amostra repetições em uma única etapa, além de encurtar o tempo de cadeira para crianças.

Com pequenas modificações podem ser degustadas doentes periodontais. Aqui pontos papel precisará ser inserido em todo o comprimento do bolso, que pode atingir até 10 mm. O comprimento e conus dos pontos de papel, bem como a profundidade de inserção devem ser adaptados ao habitat intra-oral de interesse, mas sempre deve ser padronizado pelo material e dimensões. Podem também ser recolhidas amostras de mucosa usando pontos de papel. Protocolos idênticos permitem comparações de diferentes habitats orais e vários materiais dentários. Preparação do paciente e armazenamento da amostra podem ser realizadas conforme descrito neste vídeo. Para pesquisa de metatranscriptome, RNA pode ser saboreado com o mesmo método. Assim, após a amostragem, os pontos de papel devem ser inseridos diretamente na solução de estabilização de RNA.

Limitações da técnica:

Independentemente de modificações, o método de amostragem clínicos que descrevemos é limitado ao som sulco subgengival. Outros locais de amostragem, quanto remover doentes bolsos de exemplo, não eram parte do nosso projeto de estudo. Como amostragem de toda a profundidade de tais bolsas é necessário, pontos de papel podem não ser grandes o suficiente para coletar amostras suficientemente. Se o objetivo experimental é comparar os dados amostrados de som sulci subgengival e bolsos remover doentes, é importante estar ciente de viés inerente associado com métodos de amostragem clínicos diferentes. Portanto, não é aconselhável comparar esses dados.

Uma limitação do método aqui apresentado é amostragem sem o uso subsequente de propidium monoazídico. Adicionar este agente diretamente após a amostragem permite a análise específica de apenas as células vivas no biofilme analisados. O método de amostragem descrito aqui reflete o número de células vivas e mortas. Para a pesquisa da periodontite severa, pontos de papel provavelmente precisará ser substituído por curetas, como formação de biofilme em bolsos é forte. Ponto de papel amostragem pode não refletir a todo o espectro microbiano nestes casos, como a sua superfície pode ser saturado muito rapidamente.

Importância no que diz respeito a métodos existentes:

O manuscrito proposto é o primeiro de seu tipo para padronizar subgengival amostragem no sulco saudável com pontos de papel. Outros relatórios referiram-se ao uso de curetas metal^35,36 ou papel pontos ^37,38,39, mas não descrever os processos que ocorrem antes da amostragem, tais como o controle de placa bacteriana, limpeza do dente, dente isolamento e secagem, bem como os processos que resultam de especificações inadequadas nas linhas de técnica e tempo de amostragem.

Em dois artigos anteriores, mostramos que o uso de pontos de papel é um método reprodutível para recolha de amostras de biofilme subgengival em crianças^22,40. Devido ao seu design, curetas são demasiado grandes para o sulco raso com espaço limitado e muito afiada para o epitélio juncional concurso. É crucial acessar o sulco subgengival sem traumatizar o epitélio. Desta forma, evita-se preconceito decorrentes da hemorragia. Assim, o uso dos pontos de papel fino e macio é preferencial para esta área. Pontos de papel são funcionais para monitorar as alterações na composição do biofilme durante o tratamento ortodôntico^21,41. Eles são magros e flexível o suficiente para caber entre os elementos dos aparelhos ortodônticos fixos. Esta é uma grande vantagem para outros métodos de amostragem como curetas. Atraumatic amostragem é simplificada e amostragem de pequenas quantidades de DNA é possível.

Aplicações futuras:

Neste vídeo demonstramos o método na dentição permanente, precoce e não-doentes. Também pode ser aplicado à dentição mista ou madura. Com algumas adaptações é possível remover doentes sites como dentes ou implantes e outros nichos devido a materiais dentários da amostra, seguindo o mesmo protocolo. Pesquisa de cárie pode beneficiar deste protocolo padronizado, em particulares estudos sobre cárie de raiz. A palestra mais importante de nossa vídeo de amostragem é a padronização dos protocolos para tornar os dados comparáveis, não importa o que e como as amostras são medidas.Futuras demonstrações de vídeo poderiam melhorar o campo de colheita de amostras clínicas em geral.

Biofilme oral obtido como mostrado no vídeo é usado em clínicas e para investigações científicas. Esta abordagem na vivo representa uma boa adição a em vitro técnicas moleculares como a hibridação do in situ de fluorescência e microscopia¹⁵de exploração do laser confocal. NGS métodos, como mostrado aqui, o pyrosequencing aplicada para o biofilme coletado, permitem a análise da microbiota completa. Calcular a abundância relativa de certas espécies bacterianas pode ser usado para tratamentos de suporte ou para comparar diferentes pacientes ou tratamentos diferentes. Juntamente com um sequenciamento padronizado protocolo e sequência de análise de fluxo de trabalho que temos anteriormente descrevem⁴⁰, este método de amostragem permite a análise de sequência até ao nível de gênero. Mais “meta”-estudos, tais como metatranscriptomic ou metabolómica estudos são possíveis baseiam no protocolo de amostragem apresentado neste vídeo.

Passos críticos:

Evitar a contaminação é uma etapa crítica: instrumentos esterilizados têm de ser aplicadas em um ambiente não-estéril na vivo . A transferência da boca para o banco tem de ser realizada rapidamente e firmemente por um examinador experiente para manter o tempo de cadeira para os participantes do estudo tão curtos quanto possível. O passo mais crítico no protocolo é a inserção atraumática do ponto para o sulco subgengival de papel. Ruptura do epitélio juncional e sangramento absolutamente tem que ser evitado. Mais tem que ser tomado para não contaminar pontos de papel e armazenamento frascos com exógeno DNA ou RNA. O armazenamento em seguida também é uma etapa crítica. Precisam de amostras a serem congelados directamente, na melhor das hipóteses, −80 ° C. Isso evita mudanças na amostragem de post composição bacteriana, que iria falsificar resultados de sequenciamento.