密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

注意: S. 菌 を使用すると、受信者のひずみとして場合、s. 菌 が胃腸の病気を引き起こす可能性が人間の病原体であることに注意してください。適切なバイオ セーフティ対策 (ヨーロッパおよび米国の BSL 2 またはニュージーランドで PC2 を指定) と 米菌 を含む実験を行う必要があります。このプロトコルに関連付けられているビデオのすべての実験が行われた非病原性 大腸菌 のよ特徴付けられた受信者ひずみを用いた MG1655 PC1 の設定で。赤痢菌 と以前行ったバーゼル, Biozentrum BSL 2 研究室の 6 で説明した。 注: 2 回効果的に次の実験を行っています。(ステップ 1.1-ステップ 4.5) の最初の部分は、めっき用最高希釈を見つける目標が与えるプレートあたりの多くの個々 のコロニーが多く活用の希釈に芝生フォームを見つけるには、ライブラリに実行されます。これは、大幅に削減できるフィットネスの突然変異体とより堅牢なフィットネスとのそれら間の競争を減らすことです。(手順 5.1 7.4) の 2 番目の部分は、多くのプレートは、ライブラリの適切な希釈に広がっている最後のライブラリの作成。 1。 に準備 1 日事前実験する Inoculate、冷凍在庫、流体培養基 LB の 2 mL でドナーのひずみからミラーズ レシピ (10 g/L の NaCl) メディア 100 μ g/mL にアンピシリンを含みます。ここで使用されるドナーひずみは 大腸菌 BW20767 15 pJA1 プラスミド 11 をかくまっています。アンピシリンの使用 pJA1 のプラスミッドのための選択を保持します。 単一コロニーや冷凍ストック以外、かカナマイシン、アンピシリン抵抗性マーカーと LB 媒体の 2 mL で受信者のひずみからの Inoculate。ここで使用される受信者のひずみは 大腸菌 " 野生型 " ナリジクス酸に対する自然抵抗性変異株による MG1655 17 , 18 のひずみ。それは 30 μ g/mL ナリジクス酸で栽培されています。 (90 mM シャーレ、約 12.5 mL) で準備 20 ルリアスープ含む 1.5% 寒天版。抗生物質を欠けている寒天を使用するまで数ヶ月の 4 ° C で保存ことができます。 (90 mM シャーレ、約 12.5 mL) で準備 20 ルリアスープ含む 1.5% 寒天版両方 30 μ G/ml でナリジクス酸で 50 μ g/mL (LBA Nal30 Kan50) カナマイシンを含みます。抗生物質を含む寒天を使用するまで数ヶ月の 4 ° C で暗闇の中で保存ことができます。 は、200 mL 滅菌 LB 媒体を準備します。LB メディアが数ヶ月常温で保存できます。 メーカーによると 1 mL 100 mM の IPTG、滅菌在庫を準備 ' の指示。 2。細菌の交配や共役 室温で 1 分 14,000 x のためのドナーのひずみの一晩文化の遠心 1 mL g。成長媒体を破棄します。抗生物質を含むすべての成長媒体を削除するこの手順を実行します。 文化を集中の LB (抗生物質を含まない)、110 μ L に細胞ペレットを再懸濁します。 使用して滅菌鉗子位置滅菌硝酸セルロース フィルター (または滅菌一枚のあぶらとり紙は使用できますが、資料を参照してくださいリスト) (抗生物質を含まない) LBA プレートの真ん中に。ラベル プレート " ネガティブ コントロール: ドナー ". フィルター上に濃縮されたドナー文化の 50 μ L をドロップ、ピペットを使用しています。 手順 2.1-4 受信者のひずみのプレートをラベル付け " ネガティブ コントロール: 受信者 "。 ライブラリの (これらのプレートが抗生物質を含めないでください) LBA プレートに 1 つの滅菌フィルターに (ステップ 2.5) から受信者負担の (手順 2.2) からドナーと 50 μ L の 50 μ L をドロップします。このプレートをラベル " ライブラリ " 交配が発生するためドナーと受信者フィルターに近く物理的な接触で。 6 h の 37 ° C でフィルターを含む寒天プレートを配置 3。PJA1、トランスポザーゼの IPTG 誘導によるトランスポゾンの活性化 準備 3 15 mL コニカル バイアル 1 mM (すなわち IPTG の 100 mM の在庫の 20 μ L) の最終的な集中に IPTG と LB の 2 mL を含みます。それぞれのラベル: ドナー管理、受信者コントロールおよびライブラリ。 は、(ステップ 2.4) から 37 ° C で成長の 6 h 後インキュベーターからプレートを削除します。いくつかの細菌の増殖は、フィルター上に表示する必要があります。 使用滅菌鉗子は、ドナー管理からろ紙を削除し、15 mL コニカル バイアル (ステップ 3.1) からドナー コントロールをラベルに配置。受信者コントロールとライブラリの同じ操作を行います。 15 mL コニカル バイアルの底にろ紙を取得し、ポンドに完全に浸漬を確保する管をタップ 渦管を完全な少なくとも分高硝酸セルロース フィルターから細菌の関連付けを解除します。LB は細菌細胞 ( 図 2) と曇りになります。 というラベルの付いた LBA Nal30 Kan50 プレートの上にドナーの管理から vortexed 細菌懸濁液 200 μ L をプレート滅菌ガラス ビーズまたは滅菌スプレッダーを使用して " ドナー管理、200 μ L " です。 プレートをラベリング、受信者コントロールについて (3.6) 上記手順を繰り返します " 受信者コントロール、200 μ L " です。 プレートをラベリング ライブラリに (3.7) 上記手順を繰り返します " ライブラリ、200 μ L " です。 (すなわち 1:5、1:10 と 1: 100 希釈液、希釈剤として抗生物質を含まない LB を使用して) 追加の希薄を作るライブラリの。適切なラベル LBA Nal30 Kan50 プレートをプレート 200 μ l の原液ライブラリおよび追加希薄にします。 フィットネスの大規模な損失を引き起こす遺伝子に挿入されたトランスポゾンと 18 h のクローンの 37 ° C に場所プレート インキュベーターは成長し、プレート上に表示に時間がかかります。コロニーのサイズ ( 図 3) の様々 な必要があります。ドナーと受信者のひずみプレートはありませんそれらのコロニーです。 4。最終的な突然変異体のライブラリに使用するライブラリの適切な希釈を選択 を決定するさまざまなサイズの多くの植民地をもたらすステップ 3.9 からライブラリの希釈の間隔は十分に。目的は、植民地が互いにマージし、リソースの競合として 1 つの皿の上可能ですが、あまりに多くの植民地を得ることです。この番号は、プレート当たり約 500-2,000 の植民地をする必要があります。皿の上の適切なコロニーの密度の例は 図 3 に示す. 版のコロニーの数を記録します。 共役 (受信者の細胞 1 個あたりの conjugants 数) の周波数を計算します。これは 1 x 10 -6 19 1 x 10 -4 の範囲にする必要があります。 は、ダウン ストリーム アプリケーションに基づいて最終的なライブラリで必要な突然変異体の数を決定します。多くのユーザーは単に可能な限りとして多くのミュータントとライブラリを必要と。可能な理論としての多くトランスポゾン挿入を生成する (1 つ挿入すべての塩基対)、おおよその目的ly (すなわち、エシェリヒア属大腸菌 の ~4.5 x 10 6) ゲノムの塩基対と同じ数のコロニーのすべての可能なトランスポゾン挿入でゲノムを完全に飽和します。それは、エッセンシャルで挿入を抱いて多くの突然変異体に注意してくださいすることが重要または機能的に重要な遺伝子はこれらの突然変異は受信者に致命的になるよう、回復することができません。 は、最初のライブラリの容量がどの程度が希望するサイズのライブラリを作成する必要を計算します。たとえば、目的のライブラリのサイズは 5 × 10 4 変異体です。ステップ 3.9 からコロニーの最も適した間隔で希釈された 200 μ L、1:10 の希釈。このプレートのコロニーの数は、約 2,000 のコロニーをすると推定されます。5 × 10 4 変異体が必要し各プレートは 2,000 の植民地なら 25 枚この希釈に必要になります。 5。最終的な突然変異体ライブラリの作成 手順 1 から 3.8 (手順 4.4 参照) を必要に応じて手順 1.4 で板の数を調整します。 3.9 のステップで目的のサイズのライブラリを作成する必要に応じて、できるだけ多くのプレートの上に 4.1 で希釈をプレート (手順 4.4 参照). 6。ライブラリ密度推定 プレートあたりどのように多くのコロニーをカウントし、それによってライブラリがどのように高密度の大まかな見積もりを得る。たとえば: 2 x 10 5 植民地の合計はメッキします。大腸菌 MG1655 ゲノムは約 4.5 × 10 6 塩基対です。したがって、約 2 × 10 5 ライブラリを挿入、挿入 の平均 があることを意味すべての 22 の塩基対と、約 1 × 10 の 3 塩基対の各遺伝子必要があります変更約 45 倍、その 1 つの遺伝子を与えられました。必須遺伝子の挿入がこのライブラリの非常に過小評価する可能性があります、したがって非必須遺伝子の密度がこれよりも大きくなる可能性が。この種の計算はトランスポゾン密度の広範な見積もりとの 1 つを提供します。 7。トランスポゾン ライブラリおよびストレージ プール コロニーを数え、ライブラリ プレートに LB (または必要に応じてなど) の 1 つの mL を追加し、プレートから細菌をこすり落とすため滅菌の拡散機を使用します。細菌懸濁液を除去し、50 mL と 15 mL コニカル バイアルに置き。すべての版の繰り返し。 渦完全な分のプールされた細菌懸濁液懸濁液を均一にします。 最終濃度 20% に滅菌グリセリンを追加。 簡単再成長のための 0.25 mL 管 100 x 20 μ 因数を準備します。 少なくとも 2 つ以上クリオバイアルで分注 1 mL を準備します。 -80 ° C ですべての因数を保存