יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

שים לב: אם משתמש flexneri ס כמו זן הנמען, אנא שימו לב כי ס flexneri פתוגניות שיכולים לגרום מחלות במערכת העיכול. בניסויים המערבים flexneri ס חייב להתבצע עם הזהירות המתאימה אבטחה (המיועד BSL-2 ב אירופה, ארה ב או PC2 בניו-זילנד). כל הניסויים שבוצעו וידאו הקשורים עם פרוטוקול זה נעשו באמצעות מזן הנמען מאופיין היטב פתוגניים שאינם e. coli MG1655 באווירה PC1. עבודה עם flexneri שיגלה בעבר בוצע במעבדה BSL-2 בבית Biozentrum בבאזל, כמתואר ב- 6- הערה: הניסוי הבאות ביעילות מתבצעת פעמיים. החלק הראשון (שלב 1.1 – שלב 4.5) מבוצע כדי לגלות דילול הטוב ביותר עבור ציפוי הספרייה, שבו המטרה היא למצוא לדילול של הבניין אשר נותן הרבה מושבות נפרדות לכל צלחת, אבל לא כל כך הרבה זה טפסים על הדשא. זה כדי להפחית את התחרות בין מוטנטים עם כושר מופחתת באופן משמעותי ואלה עם כושר עמידים יותר. החלק השני (שלבים 5.1-7.4) הוא היצירה של הספרייה הסופי, שבו מתפשטים הצלחות רבות של דילול המתאים של הספרייה. 1. כדי להכין אחד היום לפני הניסוי Inoculate, ממניה קפוא, המתח התורם ב 2 מ ל מרק ליברות, מילר מתכון (NaCl ב 10 גרם/ליטר) מדיה המכיל אמפיצילין-µg 100/mL. המתח התורם המשמש כאן הוא המתח e. coli BW20767 15 מחסה פלסמיד pJA1 11. השימוש אמפיצילין שומרת על הבחירה עבור פלסמיד pJA1. Inoculate, מושבה בודדת או מניות קפוא, המתח. הנמען ב 2 מ של המדיה ליברות עם סמן ההתנגדות אמפיצילין או kanamycin. המתח. הנמען המשמש כאן הוא e. coli " פראי סוג " זן MG1655 17 , 18 עם מוטציה התנגדות ספונטנית ליצירת חומצה nalidixic. הוא גדל בחומצה nalidixic 30 µg/mL. להכין מרק לוריא 20 המכילה אגר 1.5% הצלחות (90 מ מ פטרי, כ מ”ל). פלטות אגר חסר אנטיביוטיקה שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים עד שימוש. להכין מרק לוריא 20 המכילה אגר 1.5% הצלחות (90 מ מ פטרי, כ מ”ל) המכיל חומצה nalidixic-30 µg/mL הן והן kanamycin ב 50 µg/mL (lba של Nal30 Kan50). פלטות אגר אנטיביוטיקה ניתן לאחסן בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים עד שימוש. להכין 200 מ של מדיה LB סטרילי. LB מדיה שניתן לאחסן בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים. להכין 1 מ”ל של 100 מ מ מלאי סטרילי של IPTG, על פי היצרן ' הוראות s. 2. חיידקי הזדווגות או ההטיה g צנטריפוגה 1 מ”ל של תרבות לילה של המתח התורם במשך דקה אחת ב- 14,000 x בטמפרטורת החדר. למחוק את הצמיחה מדיה. שלב זה נעשה כדי להסיר את כל המדיה צמיחה המכילה אנטיביוטיקה. Resuspend בגדר תא לתוך µL 110 של ליברות (לא מכיל אנטיביוטיקה), ולכן ריכוז התרבות. באמצעות מלקחיים סטרילי, מיקום מסנן סטרילי ניטרוצלולוזה (לחלופין פיסת נייר סופג סטרילי יכול לשמש, ראה חומרים רשימה) אל אמצע צלחת LBA (לא מכיל אנטיביוטיקה). לתייג את הצלחת " בקרה שלילית: התורם ". באמצעות פיפטה, ירידה µL 50 של התרבות התורם מרוכז על המסנן. חזור על השלבים 2.1-4 לזן של הנמען, תיוג את הצלחת " בקרה שלילית: הנמען. " של הספריה, ירידה 50 µL של µL ו- 50 התורם (מתוך שלב 2.2) של המתח הנמען (מתוך שלב 2.5) על גבי מסנן סטרילי בודד בצלחת LBA (הצלחות האלה אין לכלול אנטיביוטיקה). תווית זו צלחת " הספריה. " הזדווגות מתרחשת כיוון התורם ואת המטופל נמצא במגע פיזי קרוב מסנן. מקם את הצלחות אגר המכיל את המסננים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6-אייץ 3. הפעלה של pJA1 Transposon על ידי IPTG אינדוקציה של Transposase להכין שלוש 15 מ”ל חרוט מבחנות שמכילות 2 מיליליטר ליברות עם IPTG-ריכוז סופי של 1 מ מ (כלומר, µL 20 מ מ 100 מניות של IPTG). תווית אחד: התורם שליטה, שליטה הנמען, וספריית. להסיר את הצלחות של החממה לאחר 6 שעות של צמיחה ב 37 מעלות צלזיוס (מתוך שלב 2.4). התפתחות חיידקים מסוימים צריך להיות גלוי על המסנן. באמצעות מלקחיים סטרילי, מסירים את נייר סינון מהפקד התורם ומניחים אותו בבקבוקון חרוט 15 מ”ל שכותרתו התורם שליטה (מתוך שלב 3.1). לעשות את אותו הדבר עבור נמען שליטה והספרייה- הקש על הצינורות כדי לקבל נייר הסינון לתחתית המבחנה חרוט 15 מ”ל ולהבטיח כי זה מלא שקוע ב- LB. וורטקס צינורות במשך לפחות דקה גבוה כדי לבטל שיוך של החיידק מהמסנן ניטרוצלולוזה. LB צריך להיות מעונן עם תאים חיידקיים ( איור 2). באמצעות חרוזי זכוכית סטריליים או מפזר סטרילי, צלחת µL 200 של ההשעיה חיידקים vortexed מהפקד התורם על גבי לוחות LBA Nal30 Kan50 הנקרא " התורם שליטה, 200 µL ". חזור על השלב מעל (3.6) עבור הפקד הנמען, תיוג הלוחות " נמען שליטה, 200 µL ". חזור על השלב מעל (3.7) של הספריה, תיוג הלוחות " ספריה, 200 µL ". להפוך דילולים נוספים (כלומר, 1:5, 1:10 ו- 1: 100 דילולים, באמצעות LB אשר אינו מכיל אנטיביוטיקה כמו diluent) של הספרייה. צלחת 200 µl ספריית מדולל ו דילולים נוספים על גבי תווית כראוי צלחות lba של Nal30 Kan50. חממה המקום צלחות לתוך 37 ° C עבור ה 18 שיבוטים עם טרנספוזונים מוכנס גן שגורם לאובדן כושר גדול עלול לקחת יותר זמן לגדול, מופיעים על הצלחת. צריך להיות מגוון של גדלי המושבה ( איור 3). התורם וצלחות זן הנמען צריך אין מושבות עליהם. 4. לבחור דילול המתאים של הספרייה שישמש עבור ספריית מוטנטים הסופי לקבוע לדילול של הספרייה מ- 3.9 שלב המניבה מושבות רבות בגדלים שונים זה ירווחו כראוי. המטרה היא להשיג מושבות רבות ככל האפשר בצלחת, אבל לא כל כך הרבה כי המושבות למזג לתוך אחד לשני, להתחרות על המשאבים. מספר זה צריך להיות כ 500-2000 מושבות לכל צלחת. דוגמה של צפיפויות המושבה המתאים על צלחת מוצג באיור 3. לרשום את מספר מושבות על הלוחות. לחשב את התדירות של ההטיה (מספר conjugants לכל תא הנמען). זה צריך להיות בטווח של עונה 1 פרק 10 -4 עונה 1 פרק 10 -6 19. לקבוע את מספר מוטציות הרצוי בספריה סופי המבוסס על יישומים במורד הזרם. משתמשים רבים פשוט דורשים ספרייה עם מוטציות רבות ככל האפשר. כדי להפיק כמה שיותר transposon הוספות כמו תיאורטית אפשרית (הכניסה אחד כל זוג בסיסים), כוון משוערly אותו מספר של המושבות בסיסים בגנום (כלומר, ~4.5 x 10 6 עבור e. coli) מלא עיתוני הגנום עם כל הוספות transposon אפשרי. חשוב לציין, מוטציות רבות מחסה הוספות ב חיוני או גנים חשיבות תפקודית לא יוכלו להיות התאושש, כמו מוטציות אלה יהיה קטלני אל הנמען. לחשב כמה נפח של הספרייה הראשונית יש צורך ליצור ספריה בגודל הרצוי. לדוגמה, גודל הספרייה הרצוי הוא 5 x 10 4 מוטציות. הדילול עם המרווח הטוב ביותר של מושבות של 3.9 שלב היה 200 µL של 1:10 דילול. מספר מושבות על הצלחת הזו מוערך כ- 2,000 מושבות. 5 x 10 4 מוטציות נדרשים ואת כל צלחת יש מושבות 2,000, אם יהיה צורך 25 צלחות-דילול זה. 5. הקמת ספריית מוטנטים הסופי חזור על שלבים 1 עד 3.8, התאמת מספר צלחות בשלב 1.4 כנדרש (ראה שלב 4.4). שלב 3.9, צלחת דילול שבחרת בשלב 4.1 על גבי לוחות רבים לפי הצורך כדי ליצור את הספריה בגודל הרצוי (ראה שלב 4.4). 6. להעריך את ספריית צפיפות לספור כמה מושבות הם לפי הלוח, ובכך לקבל הערכה גסה של הספריה היא כמה הוא צפוף. לדוגמה: סך של 2 x 10 5 מושבות הם מצופים. הגנום MG1655 e. coli הוא בערך 4.5 x 10 6 בסיסים. לכן, ספרייה עם 2 x 10 בערך 5 מוסיף כלומר יש הוספה בממוצע כל 22 זוגות בסיס, כי כל הגן צריכה להיות מוטציה כ- 45 פעמים, נתן את אחד הגנים הוא כ 1 x 10 3 בסיסים. הוספות בגנים חיוניים עשוי להיות מאוד underrepresented בספריה זו, ולכן הצפיפות בגנים שאינם חיוניים היא עשויה להיות גדולה מזו. חישוב מסוג זה מספק אחד עם הערכה רחבה של צפיפות transposon. 7. איגוד ואחסון של ספריית Transposon לאחר ספירת מושבות, להוסיף 1 מ”ל ליברות (או יותר, לפי הצורך) לצלחת בספריה ולהשתמש מפזר סטרילי כדי לגרד את חיידקים מהצלחת. הסר את המתלים חיידקי ולמקם בקבוקון חרוט 50 מ ל או 15 מ”ל. חזור על כל הצלחות. המערבולת ההשעיה חיידקים במאגר דקה שלמה homogenize ההשעיה. להוסיף גליצרול סטרילי ריכוז סופי של 20%- Aliquots µL 100 x 20 0.25 mL צינורות להתכונן מחדש בקלות את הצמיחה. להכין לפחות שניים או יותר 1 מ”ל aliquot ב cryovials. אחסן aliquots כל ב-80 מעלות צלזיוס