Quantifizierung von der Fülle und Ebenen des Transfer-RNAs in Escherichia coli aufladen

Im folgenden präsentieren wir eine Methode zur Quantifizierung der spezifische tRNAs und Messung ihrer Aufladung von Nordbeflecken Ebenen. Die Methode basiert auf einer Technik, die zuerst von Varshney Et Al. entwickelt ¹. durch Ernten von Zellen in Säure Trichloressigsäure (TCA) und halten die Proben bei 0 ° C während die RNA-Reinigung, die Esterbindung zwischen der tRNA und der Aminosäure ist konservierte^2,3,4. Aminoacylated tRNAs unterschieden werden von ihren Nonacylated Pendants durch Gelelektrophorese und Nordbeflecken, zurückzuführen auf eine verminderte Beweglichkeit der Aminoacylated tRNA im Gel, verursacht durch die kovalent gebundene Aminosäure-⁵. Darüber hinaus präsentieren wir ein Protokoll für die Normalisierung der tRNA Mengen durch Zugabe von Spike-in Zellen überexprimiert selten verwendete tRNA^{SelC 4}.

tRNAs sind einige der am häufigsten vorkommende Moleküle in der Bakterienzelle und ein entscheidender Teil der Übersetzungsmaschinerie. tRNAs binden Aminosäuren und übertragen Sie sie auf die Übersetzungen Ribosomen. Die Bindung der Aminosäuren an tRNAs (Aminoacylation oder beim Laden) wird durch Aminoacyl-tRNA-Synthetasen erleichtert. Die relative Häufigkeit der verschiedenen geladenen tRNAs ist wichtig für die Treue der Proteinsynthese, zu gewährleisten, weil Unterrepräsentierung der Cognate aufgeladen tRNA für ein bestimmtes Boten-RNA (mRNA) Codon erhöht die Wahrscheinlichkeit, die ein nahe verwandtes tRNA wird liefern Sie irrtümlich die Aminosäure an die wachsende Polypeptidkette am Ribosom⁶. Die Bedeutung der geladenen tRNA spiegelt sich in der umfangreichen Antwort der E. Coli Zelle zu einem starken Einbruch in der Ladestation ein tRNA; die strenge Antwort. Während die strenge Antwort ist die Synthese von tRNAs, ribosomalen RNAs und die meisten mRNAs zu Gunsten der Transkription von spezifischen mRNAs zugeordnete Aminosäure Biosynthese und Stress überleben gesenkt, und die Wachstumsrate der Zellen sinkt dramatisch⁷ . Darüber hinaus hat neuere Arbeiten von uns und anderen gezeigt, dass E. Coli aktiv verschlechtert sich den Großteil seiner tRNA als Reaktion auf die betont, die dass die Übersetzung^4,8, begrenzen darauf hindeutet, dass die Anpassung der tRNA-Ebenen wichtig für den Umgang mit diesen Belastungen. So werden zuverlässige Messungen der tRNA Häufigkeiten und Ebenen laden ein wichtiges Instrument für bakterielle Stressreaktionen vollständig zu verstehen.

E. coli ist allgemein verwendet, um auszudrücken rekombinantes Protein und wegen der Unterschiede in Codon Usage zwischen den Arten, suboptimale Ausdruck ist ein Problem, oft vor⁹. Dies kann durch Expression von zusätzlichen tRNAs benötigt, um die rekombinante mRNA¹⁰übersetzen umgangen werden. Messungen der tRNA laden Ebenen in dieser Stämme könnte führen Problembehandlung und Optimierung der Proteinexpression.

Diese Methode ermöglicht auch die Erkennung von “mischarging”; ein tRNA-Molekül-Aminoacylated mit einer Aminosäure nicht verwandtes. Aminoacylation von verschiedenen Aminosäuren verursachen eine tRNA mit leicht unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch Polyacrylamid-Gele^1,11migrieren. In einigen Fällen kann die Methode auch verwendet werden, verschiedene Änderung Muster auf ansonsten identischen tRNAs³unterscheiden.

Ein etablierter biochemische Verfahren für die Untersuchung der tRNA Ebenen laden ist Oxidation periodate. Die Methode beruht auf der Beobachtung, dass Aminoacylated, die tRNA geschützt periodate Oxidation und ungeladenen tRNA nicht. Nach periodate Oxidationsbehandlung das Nachladen von der tRNA verwendet, um den Ladevorgang Ebenen der geernteten RNA zu schätzen. Jedoch hat das Nachladen von mehreren tRNAs gezeigt, wodurch einige Ungenauigkeiten¹²Behandlung betroffen zu sein. Die Methode hier vorgestellten Maßnahmen laden direkt vom gereinigten RNA, also ohne irgendwelche Vorurteile von chemischen oder enzymatischen Reaktionen. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass nur ein tRNA-Arten in einer Zeit, so dass zwar die gleichen Northern blot abgestreift und reprobed für mehrere tRNAs erkannt wird, ist zeitaufwendig und etwas mühsam, die Daten auf viele tRNAs zu sammeln.

Ein verlässlicher Weg der Normalisierung Proben miteinander ist vital in Studien, wo das Ziel ist, die relativen Pegel eines Moleküls über verschiedene Proben zu vergleichen. Hier stellen wir eine Normalisierung Verfahren für RNA, wo eine kleine aliquoten von E. Coli Zellen überexprimiert seltene tRNA^SelC als Spike-in der experimentellen Proben vor RNA Reinigung hinzugefügt wird. Diese Methode eignet sich nicht nur bei der tRNAs Prüfung aber für relative Quantifizierung aller Arten von RNA als der experimentelle Aufbau ist, die keine endogene RNA zu trauen kann auf die gleiche zelluläre Konzentration in den Proben präsentieren. Zum Beispiel ist das Niveau eines “Housekeeping” RNA-wie ribosomaler RNA oft verwendet, wie ein endogener Verweis auf die relativen Mengen von einem anderen RNS zwischen verschiedenen vergleichen¹³Proben. Aber dies ist von geringem Nutzen, wenn die zelluläre Konzentration der Referenz RNA zwischen Proben variiert, wie bei ribosomaler RNA der Fall sein kann, tritt Probenahme während einer Belastung Antwort^15,16,17 oder Eintritt in die stationäre Phase¹⁷. Die Zugabe von Spike-in Zellen, die experimentellen Proben vor RNA-Reinigung bietet eine solide und genaue Möglichkeit der Normalisierung unabhängig von der Probenahme-Einrichtung. Eine weitere Möglichkeit der Standardisierung ist der Zusatz von einem oder mehreren Spike-in RNAs, die experimentellen Proben nach RNA-Reinigung. Diese Methode berücksichtigt jedoch nicht für irgendwelche Unterschiede in RNA Erholung zwischen Proben.

Mit E. Coli Zellen die Overexpress Referenz RNA als Spike-in Zellen (siehe Abbildung 1) in einem Experiment auf E. Coli hat den Nachteil, das es ergibt sich darüber hinaus einer kleinen Menge von exogenen E. Coli total RNA, die Proben. Wir korrigieren für diese Ergänzung durch die Analyse einer Probe nur Spike-in Zellen parallel zu den experimentellen Proben (siehe die Northern blot in Abbildung 2, Gasse mit der Bezeichnung “SelC”). Das Protokoll dargestellt ist entwickelt für E. Coli k-12 aber dürfte für die meisten Bakterienarten anwendbar sein.