Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

tutti gli esperimenti con topi e ratti sono stati approvati e condotti utilizzando le procedure di pianificazione 1 coperti sotto l’atto di casa ufficio animali (procedure scientifiche) 1986. La ricetta di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) può essere trovata nella tabella 1. 1. acuta Hippocampal Fetta preparazione rimuovere il cervello del mouse più velocemente possibile, utilizzando una spatola e forbici per tagliare il cranio e inserirlo nella gelida affilate, ossigenato (95% O 2, 5% CO 2), alto-saccarosio ACSF (~ 100 mL). Posto nel cervello del topo su una piastra di Petri e rimuovere il cervelletto e una piccola sezione della corteccia frontale con un bisturi prima hemisecting giù la linea mediana del cervello. Posizionare i due emisferi sul lato che è stato appena tagliato e incollare ogni emisfero sul palco di un vibratomo. Tagliare 200-300 µm di spessore sezioni della regione completa di interesse. In caso di ippocampo, dovrebbero ottenere circa 3-4 fette per emisfero. Utilizzando una pipetta di Pasteur plastica, trasferire le fette in una camera sommersa ossigenato (95% O, 2, 5% CO 2) ACSF. Mantenere a 34 ° C per 30 min. Nota: Il trattamento delle fette con attivi agenti farmacologici, quali proteine ricombinanti di Dkk1, può essere eseguito in questa fase aggiungendo gli agenti alla fetta camera. Rimuovere le fette dalla camera utilizzando un pennello, inserirli in una piastra a 24 pozzetti e difficoltà per 20 min a 1 h in paraformaldeide al 4% (saccarosio PFA)/4% a temperatura ambiente (TA). Attenzione: PFA è tossico, indossare una protezione appropriata. Lavare le fette tre volte in 1X PBS (10 min. ciascuno). Nota: Il protocollo può essere sospesa qui per 1-2 giorni, finché le fette sono conservate a 4 ° C in 1X PBS. 2. Immunofluorescenza per marcatori sinaptiche Nota: le ricette di tutti i buffer utilizzati possono essere trovate nella tabella 2. Sostituire il PBS con tampone di blocco/permeabilizing (tabella 2) nei pozzetti fetta e incubare a temperatura ambiente per 4-6 h. Diluire l’anticorpo policlonale cavia contro vGlut1 1:2,000 il fattore di diluizione nel buffer blocco/permeabilizzazione. Nota: vGlut1 è un indicatore per la pre-sinaptica eccitatoria visualizzazione terminal. Per l’identificazione di sinapsi eccitatorie post-sinaptiche, utilizzare un anticorpo policlonale contro PSD-95 e diluito 1: 500 nella stessa soluzione. Utilizzare un volume minimo di 300 µ l in ogni pozzetto. Per identificare la posizione anatomica dell’ippocampo, utilizzare un anticorpo che può anche identificare la struttura neuronale, come MAP2 o tubulina. Lavorare fuori le concentrazioni corrette di tutti gli anticorpi primari per i marcatori sinaptici di scelta (pre- e post-sinaptico) e diluito in tampone fresco blocco/permeabilizing. Incubare le fette nella soluzione anticorpo primario durante la notte (o per 1-2 giorni) a 4 ° C. uso a scuotimento con vigoroso movimento. Lavare le fette tre volte in PBS (10 min. ciascuno). Diluire la 1: 500 appropriati anticorpi secondari in tampone bloccante. Ad esempio, quando si utilizza l’anticorpo di cavia vGlut1, applicare un anticorpo secondario che riconosce la componente di cavia (ad es., asino anti-porcellino d’) coniugata ad un fluorophore specifico. Quando si utilizza l’anticorpo di coniglio di PSD-95, applicare un anticorpo secondario che riconosce la componente di coniglio (ad es., anti-coniglio di asino) coniugata ad un fluorophore specifico diverso. Incubare le fette in questa soluzione per 2-3 h a RT. Accertarsi che le fette siano protetti dalla luce, come gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce. Lavare le fette tre volte in PBS (10 min. ciascuno). Attentamente togliere le fette dalla piastra 24 pozzetti utilizzando un pennello e metterli in modo uniforme su vetrini pre-etichettate. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio sopra ogni fetta e quindi posizionare delicatamente il vetrino coprioggetti sopra le fette. Evitare la formazione di bolle d’aria. Fate attenzione ad per usare abbastanza liquido di montaggio (300-400 µ l), come una quantità insufficiente può portare a secco fette. Lasciare asciugare per un minimo di 1-2 giorni a RT e mantenere le diapositive al riparo dalla luce. Archiviare le diapositive a 4 ° C nel breve termine, ma per l’archiviazione a lungo termine, conservare a -20 ° C. 3. Analisi e acquisizione di immagini confocal Imaging mediante microscopia a scansione laser confocale. Identificare la regione dell’ippocampo essere imaged (ad es., il cornu ammonis 1 e 3 (CA1, CA3) o il giro dentato (DG)) per mezzo di un 10x o 20x obiettivo. Cambiamento di un x 40 o 63 x obiettivo a immersione in olio per assicurarsi che l’anatomia della fetta è intatto identificando neurites continuo e organizzato la struttura. Utilizzare un indicatore di un neurone, quali MAP2, come riferimento ( Figura 1A). Successivamente, passare a un 60 x obiettivo a immersione in olio (NA = ~1.3 – 1.4) e regolare le impostazioni per ciascun canale per ottenere segnale ottimale e contrasto. Impostare l’intensità di ogni laser per evitare la saturazione dei pixel di utilizzando l’opzione alto / basso contrasto. Nota: Queste impostazione verrà dipendono il microscopio utilizzato, ma fare riferimento alla Tabella materiali per le impostazioni di risparmio energia di laser utilizzati in Figura 2, Figura 3, e Figura 4. Per risultati ottimali, utilizzare una risoluzione di 1024 x 1024 pixel. Le impostazioni dovrebbero rimanere costante durante le diverse condizioni dell’esperimento stesso. Zoom aggiuntivi possono essere applicati se necessario. Valutare la profondità dove la colorazione è anche e acquisire la serie di immagini di almeno 8 equidistante (250 nm) aerei. Poi prendere 3 pile adiacenti immagini rappresentative provenienti dalla stessa zona di interesse per fetta. Nota: La profondità può variare da una sezione a altra ma sempre dovrebbe essere circa 2-5 µm dalla superficie della fetta. Ripetere l’acquisizione in almeno 3 fette per condizione e da 6-8 animali per gruppo di trattamento. Image analysis. Nota: Utilizzare un software di analisi di immagine automatizzato (Vedi la Tabella materiali). Si noti che alcuni sistemi richiedono una licenza, mentre altri sono gratuiti, come ad esempio ImageJ. Il software utilizzato deve analizzare le immagini in 3D tenendo conto di tutti i piani dello stack imaged. Fare riferimento alla Tabella materiali per i dettagli del software utilizzato nell’analisi di immagine ( Figura 1). Uso un protocollo di soglia di intensità abitudine-basata per identificare tutti i puncta sinaptica e indicatori di un neurone, che manualmente sono ottimizzati e selezionati all’interno del software [vedi Tabella materiali per lo specifico software utilizzato in questo protocollo]. Nota: Il software identifica un’intensità minima e massima per ogni fluoroforo e associa una percentuale di intensità per ogni oggetto riconosciuto. Si noti che la percentuale di intensità varierà secondo il fluoroforo utilizzato e l’anticorpo contro il marcatore sinaptico. Per marcatori sinaptici, garantire che dimensione filtri (> 0.1 µm 3 e < 0.8µm 3) sono selezionati all’interno del software e applicate all’immagine. Regolare i parametri per garantire che gli oggetti selezionati non sono sovrapposte. Escludere qualsiasi oggetto che sono troppo grandi o troppo piccoli per essere considerati puncta sinaptica (Vedi Figura 2B). Nota: Una volta ottimizzato, gli stessi valori di soglia vengono quindi applicati a tutte le immagini all’interno di un determinato esperimento. Quantificare il numero medio, intensità e volume delle singola puncta sinaptica (pre- o post-sinaptico) utilizzando i protocolli ottimizzati soglia selezionati all’interno del software. Normalizzare il numero puncta al volume del campo dell’immagine (all’incirca 16.928 µm 3 nel sistema utilizzato qui). Normalizzare l’intensità puncta sinaptica per l’intensità del marcatore neuronale riferimento. Nota: Le sinapsi sono definite come la co-localizzazione tra marcatori sia pre- che post-sinaptici. Una volta i protocolli di soglia per pre- e post-sinaptico puncta hAve è stato stabilito, il software dovrebbe identificare la co-localizzazione dei puncta sinaptica come la sovrapposizione di 1 pixel o più in un unico piano. Nota: Per l’analisi statistica, confermare di che tutti i set di campioni seguano la normalità e l’omogeneità delle varianze, come determinato da Lilliefords e test χ2, rispettivamente. Campioni che presentano una distribuzione normale e l’omogeneità delle varianze dovrebbero essere analizzati con test parametrici, come descritto di seguito. Ad esempio, puncta sinaptica eccitatoria analisi devono essere eseguita utilizzando un one-way ANOVA con blocco e replica. Ogni singolo esperimento dovrebbe essere considerata come un blocco; in genere esistono tre esperimenti indipendenti, ciascuno con 1-3 topi da ogni condizione. Figura 1: analisi dei puncta sinaptica utilizzando l’analisi dell’immagine software. (A) Screenshot della personalizzazione di protocollo soglia di intensità. L’esempio fornito è per PSD-95, in cui i puncta selezionato hanno una dimensione definita di > 0,1 µm 3 e < 0,8 µm 3 e presenti oggetti sovrapposti ridotta a icona. Si noti che l’immagine mostrata è per un aereo confocale abilitare la visualizzazione più facile dei puncta sinaptica e selezione dei parametri precisi. (B) Screenshot dell’analisi uscita dal software (dopo la selezione del protocollo ottimizzato). Un esempio di crudo puncta sinaptica numeri misurazioni basate sul volume. Questi valori vengono poi esportati ad un software di foglio di calcolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: controllo di qualità delle impostazioni fetta e parametro per puncta sinaptica. Immagini confocal (A) rappresentative (obiettivo 40x) della regione di interesse: il CA1 strato radiato (sr) e strato oriens (così) di una fetta hippocampal sono identificati dalla macchiatura MAP2. Barra della scala = immagini Confocal di 2 µm. (B) (60 x obiettivo e un’ulteriore 1.3 X ingrandimento del software di acquisizione) del CA1 strato radiato, con eccitanti marcatori-vGlut1 (verde) e PSD-95 (rosso)-da fette hippocampal. Nota l’identificazione dei puncta chiaro pre- e post-sinaptico. Puncta superiore a 0,8 µm 3 sono esclusi dalla quantificazione (frecce bianche). Barra della scala = 2 µm (C) confocale immagini (60 x obiettivo e un’ulteriore 1.3 X ingrandimento del software di acquisizione) del CA1 strato radiato, con eccitanti marcatori-vGlut1 (verde)-dal criostato-taglio sezioni hippocampal dai cervelli intero risolto in PFA. Si noti la presenza di fori grandi e irregolari, ragruppata vGlut1 colorazione. Barra della scala = 2 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.