Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode für die Analyse von Kalziumsignale in Pflanzen durch die Fütterung von hemipteran Insekten wie Blattläuse generiert. Arabidopsis Thaliana verwandelt mit der GFP-Kalzium-Biosensor GCaMP3 erlauben die Echtzeit- in-Vivo Bildgebung von Kalzium Dynamik mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.
Calcium-Ionen werden voraussichtlich Schlüsselentitäten Signalisierung während biotische Interaktionen mit Kalzium Signalisierung bilden einen fester Bestandteil der Pflanze Verteidigung Reaktion auf mikrobielle spüren und Verwundung, verursacht durch das Kauen von Insekten, systemische Kalzium zu entlocken sein Signale in Pflanzen. Die Rolle von Kalzium in Vivo bei biotischen Stress ist jedoch noch unklar. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines genetisch codierte Kalzium-Sensors Kalziumsignale in Pflanzen erkennen, während der Fütterung durch eine hemipteran Pest. Hemipterans wie Blattläuse stechen eine kleine Anzahl von Zellen mit spezialisiert, länglich, saugen Mundwerkzeuge, so dass sie das ideale Werkzeug, um Kalzium Dynamik zu studieren, wenn eine Pflanze mit einem biotischen Stress konfrontiert ist, die aus einer Verwundung Antwort unterscheidet. Darüber hinaus sind fluoreszierende Biosensoren die Messung der Signalisierung Moleküle in Vivo bei Tieren und Pflanzen revolutioniert. Mit dem Ausdruck eines Biosensors GFP-basierte Kalzium, GCaMP3, in der Modellpflanze Arabidopsis Thaliana ermöglicht die Echtzeit-Darstellung der Pflanze Kalzium Dynamik während Insekten füttern, mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Eine wiederholbare und robuste-Assay wurde mit der Fluoreszenz-Mikroskopie freistehende GCaMP3 Blätter, so dass für die kontinuierliche Messung der zytosolischen Kalzium Dynamik vor, während und nach der Fütterung von Insekten entwickelt. Dies zeigt eine stark lokalisiert raschen Kalzium Höhe um die Blattlaus, die Website, die innerhalb von ein paar Minuten füttern. Das Protokoll kann andere biotische Belastungen ausgesetzt, wie z. B. zusätzliche Insektenarten, angepasst werden, während der Einsatz von Arabidopsis Thaliana zur schnellen Erzeugung von Mutanten ermöglicht die molekulare Analyse des Phänomens zu erleichtern.
Calcium (Ca2 +) ist eines der allgegenwärtige Signalisierung Elemente in Pflanzen. Ein vorübergehender Anstieg der cytosolischen Ca2 + Konzentration ([Ca2 +]Cyt) wird durch ein komplexes Netzwerk von nachgeschalteten Komponenten decodiert und engagiert sich in der Reaktion auf beide abiotischen und biotischen Beanspruchungen1,2. Ein Anstieg der [Ca2 +]Cyt ist eine der ersten Reaktionen auf mikrobielle spüren, bilden einen gemeinsamen Teil der Pflanze Verteidigung Antwort3,4,5. Anstieg der [Ca2 +]Cyt sind auch als Reaktion auf die Verwundung, verursacht durch das Kauen von Insekten wie Schmetterlinge6,7beobachtet worden. Jedoch die mögliche Rolle der Pflanze Ca2 + Signale auf biotische Bedrohungen zu leben, die nur ein paar Zellen schädigen nicht erforscht worden. Die grüne Pfirsiche-Blattlaus Myzus Persicae ist ein hemipteran Insekt, die stellt eine erhebliche Bedrohung für die Welt Landwirtschaft8,9, und Ca2 + Ausfluss aus dem extrazellulären Raum in beobachtet wurde lässt mit M. Persicae10befallen. Dieses Protokoll beschreibt eine stabile und reproduzierbare Methode zur Messung der Pflanze Ca2 + signalisiert, während M. Persicae aus Blättern, die mit einem fluoreszierenden Ca2 + Biosensor, Blattläuse und GCaMP3 Angebot neuartiger Werkzeuge, mit denen zu füttern die Rolle der Ca2 + während der biotischen Interaktionen zu sezieren.
Ca2 +-selektive Mikroelektroden wurden früher zu messen [Ca2 +] Pflanzen11,12. In jüngerer Zeit, Fluoreszenz und Biolumineszenz Ansätze sind standardisiert geworden. Diese Biosensoren binden Ca2 + und emittieren Licht, un-parallele Studienmöglichkeiten Ca2 + Dynamik in Zellen und ganze Gewebe ermöglicht. Ca2 + Biosensoren können als Farbstoffe injiziert oder stabil bei der Einführung der Biosensor Codierung Sequenz in das Genom des Organismus über Transformation (d. h. genetisch codierte Biosensoren) hergestellt werden. Letzteres bietet die großen Vorteile des Seins einfach ausgedrückt in lebender Gewebe und in der Lage, subzelluläre Lokalisation13. Das Aequorin Protein, isoliert aus Aequorea Victoria (Qualle) war der erste genetisch codierte Ca2 + Biosensor in Pflanzen14eingesetzt. Als Biolumineszenz Protein erfordert Aequorin Erregung durch Fremdlicht, nicht das Chromophor bleichen und Autofluoreszenz15vermeidet. Aequorin wurde erfolgreich verwendet, um die Fluten [Ca2 +] in Reaktion auf verschiedene Reize, einschließlich Temperatur16, Krankheitserreger17,18,19messen, Salz stress-20 ,21und verletzte7. Jedoch ist es durch die relativ niedrige Signalintensität, machen die Erkennung von [Ca2 +] Flussmittel in einzelnen Zellen und Gewebe mit schlechten Sensor Ausdruck schwer13benachteiligt.
Subzelluläre und Gewebe-Ebene Detailanalyse von Ca2 + Dynamik ermöglicht hat die Entwicklung von Ca2 + Biosensoren, die fluoreszieren können Aequorin ergänzt. Eines der am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Biosensoren sind die Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET)-basierte Cameleons. Bund Cameleons bestehen aus zwei Proteinen, in der Regel CFP und YFP, die durch die Konformationsänderung induziert durch die Bindung von Ca2 + zu einer Domäne Calmodulin in der GFP-YFP-Linker-Region in engen Kontakt gebracht werden. Dieser Kontakt ermöglicht die Übertragung von Energie von GFP YFP und die daraus resultierende Veränderung der Fluoreszenz von diesen Fluorophore ermöglicht die genaue Quantifizierung der [Ca2 +] durch die Berechnung des Verhältnisses der Fluoreszenz-Signale von den beiden Fluorophore22. Bund Cameleons sind Aequorin und nicht ratiometrischen fluoreszierende Farbstoffe, überlegen, wie sie sind weniger durch die Expression des Proteins23 betroffen und haben oft einen höheren Ertrag fluoreszierenden, zulassend zellulärer und subzellulärer bildgebenden23. Zum Beispiel wurden Bund Cameleons kürzlich, Fernverkehr Ca2 + Signale in Pflanzen zu identifizieren und lösen diese auf zellulärer Ebene24,25,26eingesetzt.
Ein neuen Durchbruch mit fluoreszierenden GFP-basierte Ca2 + Biosensoren wurde die Entwicklung von hochsensiblen Single-Fluorophor (Single-FP) Biosensoren. Single-FP Biosensoren bestehen aus einem einzigen kreisförmig artikulierte GFP im Zusammenhang mit einem Calmodulin und M13 Peptid, mit Ca2 + Bindung an Calmodulin, was zu einer Wasser-vermittelte Reaktion zwischen Calmodulin und GFP so Protonate GFP und Erhöhung fluoreszierende Ertrag27,28,29. Single-FP-Sensoren bieten einige Vorteile gegenüber dem Bund Cameleons, einschließlich einfacher experimental Design und eine potenziell höhere zeitliche Auflösung von imaging-30. Obwohl einzelne-FP Sensoren Absolute [Ca2 +] so einfach quantifizieren können nicht als Bund Sensoren sind sie überlegen, für die Analyse der zeitlichen und räumlichen Dynamik von Ca2 + 5,23signalisiert. GCaMPs sind eines der etabliertesten Single-FP Sensoren28 und wurden in mehreren Revisionen zur Verbesserung ihrer fluoreszierenden Ausbeute, Dynamikbereich, Ca2 + Affinität und Signal-Rausch-Verhältnis31,32 , 33 , 34. the GCaMPs haben erfolgreich eingesetzt in tierischen Systemen, wie z. B. Zebrafisch Motoneuronen35 und Obst neuromuskuläre Kreuzungen34fliegen. Zufällige Mutagenese des GCaMP3 führte zu zusätzlichen Klassen von Single-FP-Sensoren, einschließlich der empfindsamen GCaMP636 und die GECOs-29. Die GECOs wurden vor kurzem in Arabidopsis Thaliana (im folgenden als Arabidopsis bezeichnet) verwendet, um Ca2 + Flussmittel in Reaktion auf ATP, Chitin und die bakterielle Auslöser flg22 zu messen. Diese Studie zeigte auch, dass der R-GECO-Biosensor Bund Cameleon YC3.6 in Bezug auf maximale Signal Änderung und Signal-Rausch-Verhältnis5übertroffen.
Wegen der Leichtigkeit der Bedienung, fluoreszierende Hochzinsanleihen und hohe zeitliche Auflösung, der mit GCaMP Biosensoren erreicht werden kann, wurde GCaMP3 in Arabidopsis unter der Blumenkohl-Mosaik-Virus 35 s-Promoter genetisch codiert. Die genetische Tools für Arabidopsis Forschung ermöglichen die detaillierte molekulare Analyse der Ca2 + Signale durch GCaMP3 gemessen. Darüber hinaus kann der GCaMP3-Biosensor unter dem Fluoreszenzmikroskop, anstatt ein teurer konfokale System visualisiert werden. Dieses Protokoll ermöglicht ganz-Gewebe imaging, wichtig bei der Durchführung von Experimenten mit live biotischen Beanspruchungen. Das Experiment ist so ausgelegt, dass freistehende Blätter von 35S::GCaMP3 Pflanzen im Wasser, um Insekten entweichen zu verhindern und einschränken, Verfütterung an einem bestimmten Gewebe geschwommen sind. In diesem Artikel beschriebene Methode ermöglicht somit für die Analyse des Blattes Ca2 + Dynamik während der Fütterung von M. persicae, wodurch die Charakterisierung einer neuartigen Anlage Signalisierung Antwort. Diese Methode kann auch angepasst werden, um mit andere biotischen Belastungen wie z.B. zusätzliche Insektenarten und mikrobiellen Krankheitserregern und anderen pflanzlichen Geweben wie Wurzeln arbeiten.
In diesem Artikel beschriebene Methode ermöglicht die Echtzeit-Analyse der Pflanze Ca2 + Signalisierung bei einer biotischen Stress wie Insekten füttern. Es zeigt, dass eine der ersten Anlage Antworten auf solche Bedrohungen eine lokalisierte [Ca2 +]Cyt Höhe rund um die Futterstelle des Insekts. Diese Methode ermöglicht durch den Einsatz von Mutanten, für die die molekulare und physiologische Charakterisierung von solchen Signalen, die vorher nicht möglich war. Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll soll sicherstellen, dass die freistehende Blätter nicht übermäßig gestört beim ablösen (Schritt 3.2) oder sind bei der Übertragung von Insekten, die Blätter (Schritt 4.5). Angesichts der Tatsache, dass das aktuelle Protokoll eine relative Messung [Ca2 +]Cyt anstatt eine absolute Konzentration sieht, ist es wichtig, dass die Mikroskop-Einstellungen während des Experiments konstant gehalten werden. Es gibt auch das Potential für menschliche Voreingenommenheit bei der Auswahl des ROIs und die Analyse der Daten, und als solche, es wird empfohlen, die Experimente sind Doppel-Blind.
Es gibt mehrere bedeutende Vorteile [Ca2 +]Cyt bei biotischen Stress mit diesem Protokoll zu messen. Zunächst ermöglicht die Verwendung von einem einzigen Fluorophor mit fluoreszierenden ertragreich die Bildgebung auf einem Stereomikroskop durchgeführt werden, die ist billiger als mit einem konfokalen Mikroskop. Die Verwendung von einem einzigen Fluorophor macht auch Datenerhebung und-Analyse einfach, da gibt es nur einer Messung zu erfassen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines Stereomikroskops für die Bildgebung des gesamten Blätter, das ist wichtig, angesichts der Tatsache, dass viele biotische Interaktionen, einschließlich Anlage-Blattlaus Interaktionen, räumliche großflächig auftreten. Die hohe zeitliche Auflösung des Bildes erfassen mit GCaMP3, basierend auf die schnelle Distanzierung von Ca2 + vom Sensor nach Bindung23,30 und fluoreszierendem Hochzinsanleihen möglich, ermöglicht Messungen bis zu treffenden alle 5 s. Darüber hinaus verhindert die Blatt-Assay den Austritt des Insekts, einen Schlüssel Schritt, um solche Experimente auf ganze Pflanzen (in Vorbereitung)zu begrenzen. Die freistehende Blätter sorgen auch dafür, dass das Insekt ernährt sich von einem vordefinierten Ort, so dass für die Analyse von Ca2 + Dynamik vor, während und nach der Fütterung. Dieses Protokoll sorgt auch dafür, dass Blätter von ähnlichen Entwicklungsstufen für die Analyse verwendet werden.
Der größte Nachteil dieses Protokolls stammt aus der Verwendung eines nicht-ratiometrischen Biosensors. Mit Single-FP Biosensoren ergeben Variation der GFP-Emission aus experimentellen Variablen als [Ca2 +]Cyt, wie Veränderungen in der zellulären pH, Bewegung oder die Expression der Biosensor. Diese Fragen sind nicht mit Bund Cameleons beim Bund, anzutreffen, wie die Übertragung von Energie von GFP, YFP nur auf Ca2 + Bindung tritt. Andere Bedingungen, die die fluoreszierenden Eigenschaften des einzelnen Fluorophore verändern werden voraussichtlich die gegnerischen Änderungen in der Intensität der CFP und YFP zu imitieren, und die ratiometrischen Berechnung, die von Natur aus verwendet wird normalisiert die Messungen für viele dieser andere optische Artefakte23,30. Schätzungen des absoluten [Ca2 +]Cyt wird dadurch zuverlässiger mit Bund Cameleons. Infolgedessen GCaMP3 als eines Biosensors eignet sich besonders zur Messung der relativen [Ca2 +]Cyt, obwohl es immer noch reicht zu erkennen und zu charakterisieren, biologische Phänomene in Pflanzen5,(in preparation). Daher ist es unerlässlich, Steuerelemente zu verwenden, um zu zeigen, dass der beobachtete Effekt durch Ca2 +, einschließlich Ca2 +-bezogene genetische Mutanten(in Vorbereitung) oder pharmakologischen Ca2 + -Kanal-Hemmer wie La3 + . Wichtig ist, anzeigen Single-FP Biosensoren in der Regel eine höhere fluoreszierende Ausbeute und größeren Dynamikbereich (d. h. eine Erhöhung der Blüte auf Ca2 + Bindung) als Bund Cameleons23, wodurch GCaMP besser geeignet, um Gewebe-Ebene Imaging, während Bund Cameleons ein nützliches Werkzeug für die zelluläre Bildgebung mit einem confocal Mikroskop5,25 sind.
Während der Durchführung dieses Protokolls ist es möglich, dass einige Probleme entstehen, die die Problembehandlung erfordern. Beispielsweise empfiehlt es sich, dass die Proben, in denen der Kontrolle (unbehandelt) Blatt zeigt große [Ca2 +]Cyt Höhen sind (Schritt 6.3) verworfen. Solchen Transienten sind wahrscheinlich die Folge von Stress induziert durch die Mikroskopie. In der Tat, blaues Licht ist bekannt, Ca zu entlocken2 + Signale38,39,40,41, und das Licht hoher Intensität kann auch Temperatur-und osmotischen Stress führen beide auch [Ca2 +]Cyt Höhen21,25,42zu entlocken. Folglich, um solche Spannungen zu reduzieren, ist es wichtig, das Experiment in einem gut belüfteten und temperierten Raum durchzuführen und unnötig langen Belichtungszeiten zu vermeiden. Es ist auch wichtig, nicht die Blätter übermäßig stören während der Ablösung oder während der Mikroskopie, Touch entlockte [Ca2 +]Cyt Höhen43,44,45zu verhindern. Probleme können auch mit Insekten absetzen. Mit M. Persicaebegnügen sich die Insekten nicht auf den Blättern in mehreren Proben. Dies könnte eine Folge der Wunde entlockte Verteidigung in der freistehenden Blätter46,47, oder die Störung der Insekten durch das blaue Licht. In der Tat unterliegt Vision in M. Persicae drei Photorezeptoren, unter anderem mit einem Peak-Empfindlichkeit von 490 nm48. Reduzierung der Mikroskopie und Handhabung die Blattläuse mit Sorgfalt möglicherweise reduzieren Not und Ansiedlung zu fördern.
Das Protokoll in das aktuelle Papier skizzierten gibt neue Einblicke auf die molekularen Verständnis der Pflanzen-Insekten-Interaktionen und die Pflanze Reaktion auf biotischen Stress. Es ermöglicht die Visualisierung eines der ersten Anlage Antworten auf Insekten füttern und ermöglicht weitere Untersuchungen durch den Einsatz von erheblichen Arabidopsis genetischen Ressourcen zur Verfügung. Darüber hinaus dieses Protokoll ermöglicht den Einsatz von lebenden Organismen, im Gegensatz zu extrahiert49 oder spüren50. In Zukunft könnte diese Technik andere biotische Belastungen ausgesetzt, wie zusätzliche Insektenarten, Nematoden oder mikrobiellen Krankheitserregern sowie abiotischen Belastungen angewendet werden. Die GCaMP3-Mikroskopie kann auch andere Pflanzengewebe, alternative ROIs auf dem Blatt oder sogar ganze Pflanzen Bild angepasst werden. Darüber hinaus gibt es das Potenzial für die Biosensor zu genetischenLy in weitere Pflanzenarten kodiert. Infolgedessen hat das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen das Potenzial, undercover die molekulare Grundlagen der Ca2 + -Signalisierung in einer Reihe von neuartigen biotische Interaktionen zwischen Pflanzen und andere Arten.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten Grant Calder (John Innes Centre, U.K) Danke für die Beratung zur Mikroskopie. Auch möchten die Autoren John Innes Centre Gartenbau und Entomologie Abteilungen für ihre Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde von einem PhD-Zugehörigkeit aus der John Innes (TV) unterstützt die BBSRC und John Innes Foundation B/JJ004561/1 Zuschuss (t.v., M.A., j.c., S.M., s.h., T.M und D.S.), ein Jahr in Industrie-Platzierung aus dem John Innes Centre (M.A.) , ein Sommer-Zugehörigkeit aus der biochemischen Society of the UK (j.c.), JST PRESTO (M.T.) und Zuschüsse MCB 1329723 und IOS-1557899 von der National Science Foundation (M.T. und S.G.).
35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | – | Step 1.1 |
100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | – | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
Col-0 Arabidopsis | – | – | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | – | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | – | For GFP imaging (Step 4.1) |
Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | – | For image analysis (Step 6.1) |