ניצול של קפסולות עבור מכתים שלילי של דגימות ויראלי בתוך Biocontainment
Summary
פרוטוקול זה מספק הוראה עבור דגימות וירוס מכתים שלילי אשר יכול בקלות לשמש במעבדות BSL-2, -3, -4 או -4. הוא כולל את השימוש בקפסולה עיבוד חדשנית, אשר מגן על רשת אלקטרונים שידור מיקרוסקופיה ומספק למשתמש טיפול קל יותר בסביבות סוערות יותר בתוך biocontainment.
Abstract
מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) משמש כדי לבחון את התשתית של וירוסים ופתוגנים פתולוגיים אחרים עם רזולוציה ננומטר. רוב החומרים הביולוגיים אינם מכילים אלמנטים צפופים המסוגלים לפזר אלקטרונים כדי ליצור תמונה; לכן, כתם שלילי, אשר מציב מלחי מתכת כבדים צפופים סביב המדגם, נדרש. כדי לדמיין וירוסים ההשעיה תחת TEM הם חייבים להיות מיושמים על רשתות קטנות מצופה משטח שקוף רק ננומטר עבה. בשל גודלם הקטן שבריריות, רשתות אלה קשה להתמודד בקלות עברו זרמי אוויר. משטח דק פגום בקלות, משאיר את המדגם קשה או בלתי אפשרי התמונה. וירוסים זיהומיים חייבים להיות מטופלים בארון biosafety (BSC) וחלקם דורשים סביבה מעבדה biocontainment. וירוסים מכתים ברמות biosafety (BSL) -3 ו -4 הוא מאתגר במיוחד כי סביבות אלה הם יותר סוערים טכנאים נדרשיםO ללבוש ציוד מגן אישי (PPE), אשר מקטין מיומנות.
במחקר זה, הערכנו מכשיר חדש כדי לסייע בוירוס מכתים שלילי biocontainment. המכשיר הוא כמוסה שפועלת כמו טיפ פיפטה מיוחדים. לאחר הרשתות נטענות לתוך הקפסולה, המשתמש פשוט שואף ריאגנטים לתוך הקפסולה כדי לספק את הנגיף ואת הכתמים לרשת encapsulated, ובכך ביטול טיפול המשתמש של רשתות. למרות טכניקה זו תוכננה במיוחד לשימוש BSL-3 או -4 biocontainment, זה יכול להקל על הכנת המדגם בכל סביבת מעבדה על ידי הפעלת מכתים שלילי קל של הנגיף. שיטה זו יכולה גם להיות מיושם להכין דגימות TEM שלילי מוכתם של חלקיקים, מקרומולקולות ודגימות דומות.
Introduction
מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) הוא כלי יעיל לצפייה מורפולוגיה ו ultrastructure של דגימות ביולוגיות כי הם קטנים מדי כדי להיראות עם מיקרוסקופ אור מסורתי 1 , 2 , 3 , 4 . TEMs לירות electrons דרך דגימה דקה מאוד לייצר תמונה ברזולוציה גבוהה כמו האלקטרונים יש אורך גל קצר בהרבה מאשר אור. אזורים של המדגם כי לכופף או לחסום אלקטרונים מופיעים כהה, ואילו אזורים כי הם אלקטרונים lucent מופיעים לבן.
חוסר חומר צפוף אלקטרונים עושה וירוסים קשה להציג תחת TEM כי הם לא יכולים לפזר אלקטרונים. מכתים שלילי היא השיטה הנפוצה ביותר המשמש ליצור ניגודיות וירוסים עם נוף TEM. ההליך הראשון של מכתים שלילי הוצע על ידי ברנר ו הורן בשנת 1959, מבוסס על ניסוי שבו הול (1955) ו Huxley (1957)נראה את המראה של מבנים ביולוגיים בניגוד הפוך כאשר שקוע בחומר צפוף אלקטרונים 5 . תהליך של מכתים שלילי כבר כמעט ללא שינוי במהלך חצי המאה האחרונה. מכתים שלילי כרוך בקצרה יישום פתרון מלח מתכת כבד מדגם ברשת TEM בניסיון להקיף את הנגיף עם חומר צפוף ללא חדירת הנגיף 6 . זה יוצר גבול כהה חושף את הצורה של החלקיקים 5 . מחקר זה משתמש בשני ריאגנטים עבור מכתים שליליים, אורניל אצטט (UA) וחומצה phosphotungstic אשלגן (PTA). שני כתמים אלה משמשים בדרך כלל כתם שלילי דגימות ביולוגיות קטנות, כגון וירוסים, קומפלקסים חלבונים, וחלקיקים 7 , 8 , 9 .
הטכניקה קונבנציונאלי שלילי מכתים הוא טיפה ידנית שלילית מכתים טק7 . שיטה זו דורשת טיפול מדויק של קטנים, שברירי רשתות TEM עם מלקחיים ליישם כמויות קטנות של מדגם וירוסים, כתם, שטיפות. פרוטוקול הכנה טיפוסי כרוך החלת טיפת ההשעיה מדגם על פני השטח של רשת מצופה TEM הסרט ( איור 1 א ). לאחר ההתקשרות של המדגם למשטח הסרט, הרשת שטופה כדי להסיר וירוסים שאינם דביקים ומוכתמים עם UA או PTA למשך כמה שניות עד דקה, בהתאם לסוג המדגם. עודף נוזלים הוא מרושע מן הרשת על ידי נגיעה פיסת נייר סינון לקצה הרשת.
השיטה ידנית טיפות דורש כל רשת להיות בנפרד. אם לא מטופלים בזהירות, רשתות TEM מצופה נקב בקלות, כפוף, או מזוהמים. עיבוד דגימות מרובות יכול להוביל קשיים במעקב אחר הרשתות ולהבטיח מכתים עקביים עבור כל מדגם. הליך זה מכתים ידני הוא הרבה יותר דכאשר הוא מתבצע במעבדות ביו-בטיחותיות (BSL) -3 ו -4 ביו-מעבדות, בשל ציוד המגן האישי הנדרש (PPE) הנדרש עבור סביבות אלה. PPE הוא מסורבל הסביבה biocontainment הרבה יותר סוער לעומת מעבדה רגילה. כוח אדם העובד במעבדות Biocontainment BSL-3 נדרש ללבוש 2 זוגות של כפפות ולעבוד בארון biosafety (BSC). שכבה כפולה של כפפות מפחית רגישות מישוש ומגביל התנועה המנועית בסדר. זרימת האוויר של BSC כי מגן על המשתמש ומסייע במניעת זיהום מדגם יכול לגרום דגימות וכתמים להתייבש מהר מדי ובכך להשפיע על איכות הכתם. זרימת האוויר הסוערת חזקה ב BSC יכול גם לפוצץ במהירות את הרשת כי הוא לא מאובטח היטב. במעבדות ביו-שכבת BSL-4 קיימות דרישות בטיחות נוספות. כוח אדם נדרש ללבוש חליפת לחץ חיובית, אשר מגבילה עוד יותר תנועה פיזית ואת היכולת לראות בבירור וללכתUle רשתות. הטכנאי העובד ב BSL-4 לובש לפחות 2 זוגות כפפות, כאשר הצמד החיצוני הוא כפפה עבה אשר מקטינה באופן משמעותי את המיומנות ואת תחושת המישוש. לבסוף, מלקחיים המשמשים להתמודד עם רשתות TEM חדים, ובכך מהווה סיכון לטכנאי בשל יכולתם לנקב כפפות. עם כמוסות המכילות רשתות, מלקחיים הם לא הכרחי, ובכך לספק בטוח, מלקחיים ללא אלטרנטיבה עבור מניפולציה רשתות biocontainment. לבסוף, כמוסות גם לספק דרך יעילה לאחסן רשתות במהלך עיבוד, אודיום אדי טיהור, ובמהלך אחסון; ובכך לשמור על רשתות מאורגן ובטוח מפני נזק.
בדו"ח זה, אנו מציגים שיטה חדשה עבור רשתות מכתים שליליות של TEM במעבדות biocontainment כי מנצל mPrep / g כמוסות, מכשיר מבוסס על הקפסולה לטיפול ברשת מכתים 10 , 11 , 12 . הקפסולה מתאימהModates שתי רשתות TEM, ממזער טיפול ישיר, ומקטין את פוטנציאל נזק לרשת. הקפסולה מייחסת ישירות פיפטה אחת או רב באותו אופן כמו קצה פיפטה, המאפשר יישום של נוזלים שונים לרשת הכלולה. זה מאפשר הכנה סימולטנית של דגימות מרובות עם רשתות כפולות ( איור 1 ב ). כתם שלילי עם כמוסות המדגם וירוס הוא aspirated לתוך הקפסולה והחזיק במשך 10 דקות לתת וירוסים adsorb על פני הרשת. הרשתות עם וירוסים adsorbed נשטפים לאחר מכן עם מים deionized (dI) ומוכתמים או UA או PTA במשך כמה שניות עד 1 דקות. תהליך זה עושה שימוש באותו פרוטוקול צעדים ריאגנטים כמו שיטת טיפות ידני; ההבדל הוא שכל העבודה מתרחשת בתוך הקפסולה ללא טיפול פיזי של הרשתות. ( תרשימים 1C , 1D ).
מטרת המחקר הייתה להעריך כמוסותשיטה חדשה מכתים שלילי של דגימות וירוס בסביבות biocontainment. מחקר זה בחן גם את איכות תמונות TEM המיוצר משני הליכים שונים של מניעת הנגיף: 1) איון מהיר, עם 1% אדי tetroxide אוסמיום, ו 2) 24 שעות inactivation עם glutaraldehyde 2%. שניהם נערכו באמצעות הכמוסות. לבסוף, הערכנו שני כתמים שליליים נפוצים, UA ו- PTA, לשימוש בקפסולה. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
מכתים שלילית היא טכניקה TEM יקר להערכת ו אומדת וירוסים, קומפלקסים חלבונים וחלקיקים. הכנה דגימה של דגימות אלה על ידי הזזת ידני של רשתות מגיב לכתמים שליליים כבר פרוטוקול קלאסי במשך יותר מחצי מאה. זהו תהליך פשוט, אך דורש מומחיות שנרכשו באמצעות הכשרה להשלמה מוצלחת. מכתים ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ולהודות לד"ר ג'ון קארה ולרוואנה שוקמן על מתן ננו-אבולה ננו-VLP, ד"ר רג'יני מודסני על מתן וירוס צ'יקונגוניה, וד"ר צ'ארלס (ג'ייסון) סנדלר על מתן מורלין לוקמיה VLPs המבטאים גליקופרוטאינים של Ebolavirus. כמו כן, ברצוננו להודות ל- MAJ Carl Carl Soffler על הקלת תכנית ההתמחות של הקיץ (SIP) ועל תכנית החניכות למדע והנדסה (SEAP) ולד"ר קתרין וילהלמן על אימון בטיחות המעבדה.
Materials
| Formvar/carbon coated TEM grids | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsules | EMS | 85010-01 | box |
| mPrep/g couplers | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | 50% solution, EM grade |
| Osmium Tetroxide | EMS | 19190 | 4% aqueous solution |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | powder |
| Potassium phosphotungstic acid | EMS | 19500 | powder |
| filter paper | Whatman | 1450-090 | size 50 |
| Tranmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1011 | TEM |
References
- Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
- Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
- Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37 (2), 91-106 (2006).
- Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).
- Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. Negative staining of proteins. Electron Microsc Rev. 3 (1), 43-72 (1990).
- Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
- Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
- Bradley, D. E. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 31 (4), 230-314 (1967).
- Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).
- Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, 721 (2015).
- Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).
- Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, 174-175 (2011).
- Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
- Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).
- Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
- Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. , 403419 (2011).
- Barland, M., Rojkind, Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).
