Utilizzazione di capsule per la colorazione negativa di campioni virali all'interno del Biocontainment
Summary
Questo protocollo fornisce istruzioni per i campioni di virus di colorazione negativi che possono essere facilmente utilizzati nei laboratori BSL-2, -3, o -4. Comprende l'utilizzo di una innovativa capsula di elaborazione che protegge la griglia di microscopia elettronica di trasmissione e fornisce all'utente la gestione più agevole negli ambienti più turbolenti all'interno del biocontainment.
Abstract
La microscopia elettronica di trasmissione (TEM) è usata per osservare l'ultrastruttura di virus e altri patogeni microbici con risoluzione nanometrica. La maggior parte dei materiali biologici non contengono elementi densi in grado di spargere elettroni per creare un'immagine; Pertanto, è necessaria una macchia negativa che pone sali duri di metalli pesanti intorno al campione. Per visualizzare i virus in sospensione sotto il TEM devono essere applicati a piccole griglie rivestite con una superficie trasparente solo in nanometri spesse. A causa della loro piccola dimensione e fragilità, queste griglie sono difficili da gestire e facilmente mosse dalle correnti d'aria. La superficie sottile è facilmente danneggiata, lasciando difficile o impossibile l'immagine. I virus infettivi devono essere trattati in un armadio di biosicurezza (BSC) e alcuni richiedono un ambiente di laboratorio per la bioconvenzione. La colorazione dei virus nei livelli di biosicurezza (BSL) -3 e -4 è particolarmente impegnativa perché questi ambienti sono più turbolenti e sono richiesti tecniciO indossare equipaggiamento protettivo personale (PPE), che diminuisce la destrezza.
In questo studio abbiamo valutato un nuovo dispositivo per aiutare i virus di colorazione negativi nel biocontain. Il dispositivo è una capsula che funziona come una punta specializzata della pipetta. Una volta che le griglie vengono caricate nella capsula, l'utente semplicemente aspira i reagenti nella capsula per consegnare il virus e le macchie alla griglia incapsulata, eliminando così la manipolazione degli utenti delle griglie. Anche se questa tecnica è stata progettata appositamente per l'uso in biocontain di BSL-3 o -4, può facilitare la preparazione del campione in qualsiasi ambiente di laboratorio, consentendo una facile colorazione negativa del virus. Questo stesso metodo può essere applicato anche per preparare campioni TEM negativi negativi di nanoparticelle, macromolecole e campioni simili.
Introduction
La microscopia elettronica di trasmissione (TEM) è uno strumento efficace per visualizzare la morfologia e l'ultrastruttura di campioni biologici troppo piccoli da vedere con un tradizionale microscopio leggero 1 , 2 , 3 , 4 . I TEM sparano gli elettroni attraverso un esemplare molto sottile che produce un'immagine di risoluzione più elevata in quanto gli elettroni hanno una lunghezza d'onda molto più breve della luce. Le regioni del campione che piegano o bloccano gli elettroni appaiono scuri, mentre le regioni che sono elettricamente lucenti appaiono bianche.
La mancanza di materia elettronica densa rende difficile la visualizzazione di virus sotto un TEM perché non possono spargere elettroni. La colorazione negativa è il metodo più comune utilizzato per creare il contrasto e visualizzare i virus con un TEM. La prima procedura di colorazione negativa è stata proposta da Brenner e Horne nel 1959, basata su un esperimento in cui Hall (1955) e Huxley (1957) osservanoVeda l'apparizione di strutture biologiche in contrasto contrario quando immerse in una sostanza elettronica-densa 5 . Il processo di colorazione negativa è stato praticamente invariato nel corso del mezzo secolo. La colorazione negativa comporta brevemente l'applicazione di una soluzione salina di metalli pesanti ad un campione su una griglia TEM nel tentativo di circondare il virus con materiale densa senza infiltrarsi il virus 6 . Questo crea un bordo scuro e rivela la forma della particella 5 . Questo studio utilizza due reagenti per la colorazione negativa, l'uranil acetato (UA) e l'acido fosfatugnitico di potassio (PTA). Entrambe queste macchie sono comunemente utilizzate per negare negativamente piccoli campioni biologici, come i virus, i complessi proteici e le nanoparticelle 7 , 8 , 9 .
La tradizionale tecnica di colorazione negativa è la tecnica di colorazione negativa a goccia manualeNique 7 . Questo metodo richiede una precisa manipolazione di piccole e fragili griglie TEM con pinze per applicare piccole quantità di campioni di virus, macchia e risciacqui. Il tipico protocollo di preparazione prevede l'applicazione di una gocciolina di sospensione campione sulla superficie di una griglia TEM rivestita con film ( Figura 1A ). Dopo aver attaccato il campione alla superficie del film, la griglia viene risciacquata per rimuovere virus non aderenti e macchiata con UA o PTA per alcuni secondi a un minuto, a seconda del tipo di campione. Il liquido in eccesso è malvagio lontano dalla griglia toccando un pezzo di carta filtrante al bordo della griglia.
Il metodo manuale a goccia richiede che ciascuna griglia venga creata singolarmente. Se non vengono trattati con cura, le reti TEM rivestite sono facilmente forate, piegate o contaminate. L'elaborazione di più campioni può portare a difficoltà nel monitoraggio delle griglie e nel garantire una colorazione coerente per ciascun campione. Questa procedura di colorazione manuale è molto più dÈ difficile se effettuato nei laboratori di bioconducibilità a livello di biosicurezza (BSL) -3 e -4, a causa delle necessarie attrezzature protettive (PPE) necessarie per questi ambienti. Il PPE è ingombrante e l'ambiente di bioconvettività è molto più turbolento rispetto ad un normale laboratorio. I dipendenti che lavorano nei laboratori di bioconducibilità BSL-3 sono tenuti a indossare 2 coppie di guanti e lavorare in un armadio di biosicurezza (BSC). Questo doppio strato di guanti riduce la sensibilità tattile e limita il movimento fine del motore. Il flusso d'aria del BSC che protegge l'utente e aiuta a prevenire la contaminazione del campione può causare che i campioni e le macchie si asciugano troppo rapidamente, compromettendo così la qualità della macchia. Il forte flusso d'aria turbolento nel BSC può anche rapidamente soffiare via una griglia non ben assicurata. Nei laboratori di bioconducibilità BSL-4 ci sono ulteriori requisiti di sicurezza. Il personale è tenuto a indossare un aspetto positivo, che limita ulteriormente il movimento fisico e la capacità di vedere e manipolare chiaramenteGriglie di ulate. Il tecnico che lavora in BSL-4 indossa anche almeno 2 paia di guanti, con la coppia esterna che è un guanto spesso che riduce notevolmente la destrezza e la sensazione tattile. Infine, le pinze utilizzate per gestire le griglie TEM sono taglienti, presentando così un rischio per il tecnico a causa della loro capacità di puntare i guanti. Con le capsule contenenti griglie, le pinze non sono necessarie, offrendo così un'alternativa sicura e priva di pesi per la manipolazione di griglie nel biocontainment. Infine, le capsule forniscono anche un modo efficace per memorizzare le griglie durante la lavorazione, la decontaminazione del vapore osmio e durante lo stoccaggio; Mantenendo così le griglie organizzate e sicure da danni.
In questo rapporto, introduciamo un nuovo metodo per le griglie TEM di colorazione negativa nei laboratori di biocontainment che utilizza le capsule mPrep / g, un dispositivo basato sulla capsula per la gestione e la colorazione delle griglie 10 , 11 , 12 . La capsula accomModifica due griglie TEM, minimizza la gestione diretta e riduce il potenziale di danni alla griglia. La capsula si attacca direttamente a una pipetta singola o multicanale nello stesso modo di una punta pipetta, permettendo l'applicazione di vari liquidi nelle griglie contenute all'interno. Ciò consente la preparazione simultanea di campioni multipli con griglie duplicate ( Figura 1B ). Alla macchia negativa con capsule il campione di virus viene aspirato nella capsula e mantenuto per 10 minuti per lasciare che i virus assorbono sulle superfici della griglia. Le griglie con virus adsorbito vengono successivamente lavate con acqua deionizzata (dI) e macchiate con UA o PTA per alcuni secondi a 1 min. Questo processo utilizza gli stessi passaggi di protocollo e reagenti come il metodo manuale a goccia; La differenza è che tutto il lavoro avviene all'interno della capsula senza alcuna manipolazione fisica delle griglie. ( Figure 1C , 1D ).
Lo scopo di questo studio era valutare le capsule comeUn nuovo metodo per la colorazione negativa di campioni di virus negli ambienti di bioconvestimento. Questo studio ha inoltre esaminato la qualità delle immagini TEM prodotte da due diverse procedure di inattivazione del virus: 1) inattivazione rapida, con 1% osmio tetroxido vapore, e 2) 24 ore di inattivazione con glutaraldeide 2%. Entrambe sono state condotte usando le capsule. Infine, abbiamo valutato due macchie negative usuali, UA e PTA, per l'uso nella capsula. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
La colorazione negativa è una preziosa tecnica TEM per valutare e dimensionare i virus, i complessi proteici e le nanoparticelle. La preparazione di goccioline di questi campioni mediante movimentazione manuale di griglie dal reagente a macchie negative è stata il classico protocollo da più di mezzo secolo. È un processo semplice, ma richiede competenze acquisite attraverso la formazione per il completamento del successo. Ottima colorazione negativa è ancora considerata un set di abilità all'avanguardia e alta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere e ringraziare il Dott. John Carra e Rowena Schokman per aver fornito i nano-VLP Ebola purificati, il Dr. Rajini Mudhasani per la fornitura del virus Chikungunya e il Dott. Charles (Jason) Shoemaker per la fornitura di VLP di leucemia murina che esprimono glicoproteine Ebolavirus. Vorremmo inoltre ringraziare MAJ Carl Soffler per facilitare il programma di tirocinio estivo (SIP) e il programma di apprendistato per la scienza e l'ingegneria (SEAP) e la dottoressa Catherine Wilhelmsen per la formazione sulla sicurezza del laboratorio.
Materials
| Formvar/carbon coated TEM grids | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsules | EMS | 85010-01 | box |
| mPrep/g couplers | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | 50% solution, EM grade |
| Osmium Tetroxide | EMS | 19190 | 4% aqueous solution |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | powder |
| Potassium phosphotungstic acid | EMS | 19500 | powder |
| filter paper | Whatman | 1450-090 | size 50 |
| Tranmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1011 | TEM |
References
- Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
- Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
- Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37 (2), 91-106 (2006).
- Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).
- Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. Negative staining of proteins. Electron Microsc Rev. 3 (1), 43-72 (1990).
- Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
- Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
- Bradley, D. E. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 31 (4), 230-314 (1967).
- Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).
- Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, 721 (2015).
- Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).
- Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, 174-175 (2011).
- Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
- Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).
- Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
- Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. , 403419 (2011).
- Barland, M., Rojkind, Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).
