جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي
Summary
نحن نقدم إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين أصلية معدلة التسلسل (الرقائق-seq) منهجية لتوليد تسلسل مجموعات البيانات مناسبة ل nucleosome كثافة seq رقاقة إطارا تحليلياً إدماج ميكروكوككال nuclease (مناسى) إمكانية الوصول مع هستون تعديل القياسات.
Abstract
نحن نقدم إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين أصلية معدلة تسلسل البروتوكول التجريبية (الرقائق-seq) متوافقة مع خليط ضبابي توزيع على أساس تحليل منهجية (كثافة nucleosome seq رقاقة؛ seq ندتشيب) التي تمكن من توليد القياسات مجتمعة من إمكانية الوصول إلى نوكلياسي ميكروكوككال (مناسى) مع هستون تعديل الجينوم على نطاق المنظومة. موقف نوكليوسومي وكثافة المحلية، وتعديل تلك المفارز هستون، بوستترانسلاشونال تعمل بصورة متضافرة لتنظيم الدول النسخ المحلية. قياسات اندماجي للوصول نوكليوسومي مع هستون تعديل التي تم إنشاؤها بواسطة seq ندتشيب يسمح باستجواب واحد من هذه الميزات. منهجية seq ندتشيب ينطبق على عدد صغير من الخلايا الأولية غير قابلة للوصول على أساس رقاقة seq البروتوكولات العابرة للربط. أخذت معا، تمكن seq ندتشيب قياس هستون تعديل في تركيبة مع كثافة نوكليوسومي المحلية للحصول على رؤى جديدة في الآليات المشتركة التي تنظم الجيش الملكي النيبالي النسخ داخل الخلية الأولية نادرة السكان.
Introduction
يتم حزم الجينوم حقيقية النواة في الكروماتين عن طريق تكرار الهياكل نوكليوسومي التي تتكون من نسختين من أربعة من البروتينات هستون (مثلاً، H2A H2B، H3 و H4) مقيداً ب 146 أزواج قاعدة الحمض النووي1،2. مجمعات الكروماتين يعيد السيطرة على الموقف نوكليوسومي داخل حدود المروج الجينات والمشاركة في تنظيم التعبير الجيني عن طريق تغيير إمكانية الحصول على الحمض النووي لعوامل النسخ و الآلات رنا بوليميراز3، 4.
الأمينية ذيول هيستونيس داخل نوكليوسومي المحطة الطرفية تتعرض لمختلف التعديلات التساهمية، بما في ذلك أسيتيليشن، مثلايشن، الفسفرة، أوبيكويتيليشن، سومويليشن، فورميليشن، وهيدروكسيليشن من الأحماض الأمينية المحددة5 , 6 , 7 , 8-المناصب ودرجات من هذه التعديلات تملي دولة الكروماتين التي تؤثر على الكروماتين هيكل ومراقبة الوصول إلى المجمعات الجزيئية التي تسمح لتفعيل النسخ7. نظراً لأن كلا نوكليوسومي الكثافة وهستون تعديل تلعب دوراً في السيطرة المحلية على النسخ الجيني، طورنا نهجاً رقاقة أصلية التي تمكن من قياس متزامنة من هستون تعديل9، وكثافة نوكليوسومي 10.
Seq رقاقة الأصلي يستفيد من نوكلاس المكوّرات اندونوكليسي (منسى) لهضم الكروماتين سليمة في حالته الأصلية داخل نواة11،12، هي خاصية التي قد تم الاستدانة من أجل تعيين الموضع13 nucleosome , 14 , 15-نوكليوسومي الكثافة رقاقة-seq (ندتشيب-seq) يستفيد من خاصية الوصول التفضيلي مناسى لفتح مناطق الكروماتين لتوليد القياسات التي تجمع بين سهولة الوصول مناسى هستون تعديل10. seq ندتشيب مناسبة لتحديد سمات التعديلات هستون في نادرة الابتدائية الخلايا والأنسجة والخلايا المزروعة. نقدم هنا، بروتوكول تفصيلية التي تمكن من توليد تسلسل مجموعات البيانات مناسبة ل عمل إطار تحليلي هو موضح سابقا10 يدمج جزء حجم وظيفة إيمونوبريسيبيتيشن، يحدد نهاية إقران قراءة الحدود، إلى التحقيق الوصول مناسى مع هستون تعديل القياسات في نفس الوقت. سابقا، اشتقاق تطبيق هذا البروتوكول على دم الحبل السري البشري الأساسي 10,000 CD34+ الخلايا والخلايا الجذعية الجنينية البشرية وكشف العلاقات فريدة من نوعها بين تعديلات الهيكل وهيستون الكروماتين داخل هذه الخلية أنواع10 . ونظرا لقدرته على قياس في نفس الوقت nucleosome إمكانية الوصول إلى وتعديل هستون، seq ندتشيب قادرة على الكشف عن ميزات ابيجينوميك في عدد سكان خلية على مستوى واحد نوكليوسومي، وحل التواقيع غير متجانسة في ما العناصر المكونة لها. مثال للاستكشاف غير المتجانسة السكان الخلوية seq ندتشيب تحقيق مروجين الثنائي التكافؤ، حيث H3K4me3 وعلامة نشط، و H3K27me3، علامة قمعية، وهي الحالي10.
Protocol
ملاحظة: إدخال الحد الأدنى لهذا البروتوكول هو الخلايا 10,000 كل رد فعل واحد المناعية-هطول الأمطار (IP). طباعة ورقة العمل التجريبية التي تم توفيرها واستخدامها كمبادئ توجيهية خطة الخروج من التجربة. إينكوبيشنز في درجة حرارة الغرفة يفترض أن تكون في ~ 22 درجة مئوية. وترد كل وصفات المخزن المؤقت في الجدول 1. كافة المخازن المؤقتة ينبغي تخزينها في 4 درجات مئوية وأبقى على الجليد أثناء الإجراء، ما لم ينص على خلاف ذلك. 1-إعداد الخلية الخلايا المستزرعة تغسل الخلايا مع 1 مل من المحلول الملحي العازلة الفوسفات (PBS) وتحديد تركيز الخلية باستخدام هيموسيتوميتير دقة. إذا كان هناك أكثر من 1 مليون من خلايا، زيادة حجم برنامج تلفزيوني. استناداً إلى عدد الخلايا، الكوة ما يعادل الخلايا 70,000-100,000 إلى أنبوب معقم 1.5 مل، وتدور إلى أسفل في 500 غ x دقيقة 6 في 4 درجات مئوية. استخدام ماصة، ببطء إزالة وتجاهل المادة طافية (دون الإخلال ببيليه الخلية) وريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت لتحلل المثلج + 1 × حوزتي المانع كوكتيل (PIC) بتركيز للخلايا 1,000/ميليلتر. مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً 20-30 مرات. من الأهمية بمكان أن تتعطل كتل الخلية. ليس محاولة لخلق فقاعات. الانتقال مباشرة إلى يوم 1 (القسم 2) من بروتوكول seq ندتشيب أو فلاش تجميد بيليه الخلية في النتروجين السائل ومخزن في-80 درجة مئوية. خلايا تم فرزها جمع الخلايا تم فرزها16 70,000-100,000 في أنبوب 1.5 مل مع 350 ميليلتر الحل هانك الملح مخزنة (هبس)، أو برنامج تلفزيوني + 2% مصل بقرى الجنين (FBS). تدور أسفل كل خلية الكوة في 500 غ x دقيقة 6 في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية (دون الإخلال ببيليه الخلية) باستخدام ماصة، ببطء وريسوسبيند في المخزن المؤقت لتحلل المثلج + 1 × الموافقة المسبقة عن علم إلى تركيز نهائي للخلايا 1,000/ميليلتر. مزيج جيد في المخزن المؤقت لتحلل من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 20-30 مرة. التأكد من أن تتعطل كتل الخلية. ليس محاولة لخلق فقاعات. الانتقال مباشرة إلى يوم 1 (القسم 2) من بروتوكول seq ندتشيب، أو تجميد فلاش بيليه الخلية في النتروجين السائل ومخزن في-80 درجة مئوية. 2-يوم 1: ندتشيب-seq إعداد مجمع الأضداد-حبة تحضير حمام مائي 37 درجة مئوية ودلو الجليد. تعمل على الجليد، إعداد x IP المخزن المؤقت/1 1 × الموافقة المسبقة عن علم و 1 × جسم (Ab) إضعاف المخزن المؤقت، وإبقائهم على الجليد. استرداد الخرز المغناطيسي بالبروتين (أو G) (انظر المناقشة لمعايير الاختيار) من مخزن 4 درجات مئوية، ومزيج جيد جداً فورتيكسينج نبض لطيف. يبقيه على الجليد.ملاحظة: يعني فورتيكسينج نبض فورتيكسينج توقفت كل مرة تتشكل دوامة كامل في الأنبوب. نقل 24 الخرز المغناطيسي ميليلتر بالبروتين (أو ز) كل فعل الملكية الفكرية في أنبوب 2 مل جديدة. سجل حجم الخرز وإبقاء الأنبوب على الجليد. مثال، للمؤسسة 7، استخدام ميليلتر 24 × 7 = 168 ميليلتر. وضع الأنبوب على أنبوب المغناطيس والانتظار للحل لتصبح واضحة تشير إلى فصل حبة. دون الإخلال بالخرز، بعناية إزالة المادة طافية باستخدام ماصة وتجاهل. يأخذ الأنبوب قبالة المغناطيس أنبوب ووضعه على الجليد. إضافة وحدة تخزين متساوية (أي، حجم الأولية من الخرز) المثلج IP المخزن المؤقت + 1 x مزيج الموافقة المسبقة عن علم. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. عدم دوامة. ضع الملكية الفكرية العازلة + 1 × PIC + الخرز يعيدوه المغناطيس أنبوب والانتظار للحل لتصبح واضحة تشير إلى فصل حبة. دون الإخلال بالخرز، بعناية إزالة المادة طافية باستخدام ماصة وتجاهل. كرر الباردة IP المخزن + 1 × أغسل الموافقة المسبقة عن علم اثنين مرات أكثر لما مجموعة 3 يغسل. بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخرز في حجم متساوية (أي، حجم الأولية من الخرز) المثلج IP المخزن المؤقت + 1 x مزيج الموافقة المسبقة عن علم. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. عدم دوامة. الاحتفاظ بالانبوب على الجليد. على الجليد، صب 10 مل من المخزن المؤقت للملكية الفكرية + الموافقة المسبقة عن علم إلى خزان على شكل V 25 مل. استخدام الأقنية ماصة، إضافة 130 ميليلتر من المثلج IP المخزن + 1 × المزيج الموافقة المسبقة عن علم إلى الآبار الفردية 96 الخامس-أسفل-بئر نظيفة لوحة. سد بئر واحدة في مجال الملكية الفكرية. اللوحة كتسمية “Ab-حبة معقدة”. إضافة 12 ميليلتر من البروتين بغسلها (أو ز) المغناطيسي الخرز في كل منها أيضا يحتوي على المخزن المؤقت للملكية الفكرية + الموافقة المسبقة عن علم، ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تبقى الخرز غسلها المتبقية على الجليد. الحصول على أجسام مضادة تم التحقق من صحتها من التخزين البارد وذوبان الجليد على الجليد، إذا لزم الأمر. وتعمل على الجليد، تمييع الأجسام المضادة مع 1 x Ab تمييع المخزن المؤقت لتركيزات هو مبين في الجدول 2. لكل بئر من لوحة معقدة حبة Ab، إضافة 1 ميليلتر من الأجسام المضادة المناسبة، والمخفف (الجدول 1). سجل البئر إلى مفتاح الأجسام المضادة. استخدام ماصة متعددة القنوات، مزيج من كل صف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 20 مرة. تغيير نصائح بين الصفوف. ختم لوحة معقدة Ab-حبة جيد جداً مع غطاء لوحة ألومنيوم واحتضان في 4 درجات مئوية على منصة الدورية على الأقل ح 2.ملاحظة: يمكن أن تمضي هذه الحضانة حتى على استعداد للبدء في الخطوة 2، 4. الهضم الكروماتين وتحلل الخلية وتعمل على الجليد، إعداد 1 × تحلل المخزن المؤقت + 1 × الموافقة المسبقة عن علم، ومل 1 من منسى أنا تمييع المخزن المؤقت (الجدول 3)، والاحتفاظ بها على الجليد. استرداد الكريات الخلية من التخزين-80 درجة مئوية (أو من الجليد، إذا كان طازج). ذوبان الجليد كل خلية بيليه في حمام مائي 37 درجة مئوية ل s 10، ثم نقل الجليد. لكل خلية بيليه فورا إضافة 1 المثلج تحلل المخزن المؤقت + 1 x الموافقة المسبقة عن علم إلى تركيز نهائي من 000 10 ميليلتر الخلايا/20، ومزيج من 10 مرات قبل بيبيتينج أعلى وأسفل، دون خلق الفقاعات. على سبيل المثال، هو الحجم النهائي للخلايا 70,000 140 ميليلتر. وتعمل على الجليد، اليكووت ميليلتر 20/بئر ليساتيس الناجمة عن ذلك في لوحة 96-جيدا. تغطية اللوحة مع ختم بلاستيك واحتضان على الجليد لتسمية لوحة “هضم مناسى” 20 دقيقة وتسجيل الآبار إلى مفتاح قالب. وضمانا توقيت دقيق لرد فعل الهضم الكروماتين، لا تقم بالمتابعة الهضم مع صفوف أكثر من 2 من عينات في وقت واحد. قبل اكتمال تحلل 20 دقيقة، تضعف منسى أنا الإنزيم مع منسى أنا تمييع المخزن المؤقت، لتركيز نهائي من 20 ش/ميليلتر، وإبقائه على الجليد. تعمل على الجليد، إعداد مناسى أنا الهضم سيد ميكس وفقا الجدول 4 وميليلتر 20 اليكووت من المزيج في كل صف من العينات بالإضافة إلى 5 ميليلتر حجم القتلى في صف واحد من لوحة خزان 96-جيدا وإبقائه على الجليد. لصفين، يجب أن تكون وحدة التخزين: (20 ميليلتر x 2) + 5 ميليلتر = ميليلتر 45. بعد إنهاء ليساتيس حضانة، إزالة لوحة الهضم منسى من الجليد. باستخدام الأقنية ماصة، إضافة 20 ميليلتر من منسى أنا الهضم ماجستير المزيج إلى كل صف من العينات، ومزيج 10 مرات من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تغيير نصائح بين الصفوف. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق بالضبط. بعد 5 دقائق، لوقف رد الفعل، واستخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 6 ميليلتر من 250 ميكرون الإيثيلين حمض (يدتا) في كل صف من عينات ومزيج صعودا وهبوطاً عدة مرات. تغيير نصائح بين الصفوف. بعد إضافة يدتا، التبديل الإعداد الماصة 20 ميليلتر ومزيج 10 مرات من بيبيتينج صعودا وهبوطاً لضمان وقف كامل لرد فعل الهضم. تغيير نصائح بين الصفوف. استخدام ماصة متعددة القنوات، لكل صف من العينات مناسى هضمها، إضافة ميليلتر 6 من 10 × تحلل المخزن المؤقت ومزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 مرات. تغطية مع ختم بلاستيك، واحتضان في الثلج لمدة 15 دقيقة. الفصل بين المدخلات والتخليص المسبق بعد الاحتضان 15 دقيقة، تعمل على الجليد، وتجمع جميع الآبار لنفس الخلية بيليه/قالب واحد العقيمة، قبل مبردة على الثلج وأنبوب 1.5 مل (المسماة مسبقاً مع معرف القالب) ومزيج دقيق ولكن ببطء باستخدام ماصة تجنب الإرغاء المنظفات. لكل خلية بيليه/قالب، نقل 8 ميليلتر الكروماتين هضمها إلى جديدة معقمة وأنبوب 0.5 مل (المسماة مسبقاً مع معرف القالب)، ومخزن في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. وهذا سيكون بمثابة عنصر تحكم الإدخال. توزيع حجم المتبقي من الكروماتين هضمها في 48 ميليلتر مختبرين، إلى لوحة 96-بئر جديدة. خلية بيليه/قالب 1 يذهب إلى الآبار A01-A06، خلية بيليه/قالب 2 يذهب إلى آبار A07-A12، إلخ. تسجيل الآبار إلى مفتاح قالب. قم بتسمية “قبل إزالة” اللوحة. استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة ميليلتر 120 1 × IP المخزن المؤقت + 1 × الموافقة المسبقة عن علم وميليلتر 12 من غسلها الخرز المغناطيسي بالبروتين (أو G) في كل من لوحة التخليص المسبق جيدا من الخطوة 2.3.3. مزيج من كل صف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 مرات. تغيير نصائح بين الصفوف. إغلاق اللوحة جيد جداً مع غطاء لوحة ألومنيوم واحتضان على منصة الدورية عند 4 درجة مئوية للحد ني ح 2. تفاعل إيمونوبريسيبيتيشن قبل البدء في هذه الخطوة تأكد من أن لوحة حبة Ab المعقدة (الخطوة 2.1.10) ولوحة التخليص المسبق (الخطوة 2.3.4) قد المحتضنة لتدور على الأقل 2 حاء السريع على حد سواء لوحات من سينتريفوجينج لمدة 10 ثانية في 200 x ز. ضع لوحة معقدة حبة Ab (من الخطوة 2.1.10) على لوحة مغناطيس وانتظر 15 ثانية للحل لتصبح واضحة. بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية باستخدام ماصة دون إزعاج الخرز. إزالة اللوحة من لوحة المغناطيس وإبقائه على الجليد. ضع لوحة رد فعل التخليص المسبق (من الخطوة 2.3.4) على لوحة مغناطيس وانتظر 15 ثانية الخرز لفصل والحل لتصبح واضحة. دون الإخلال بالخرز، نقل بدقة المادة طافية باستخدام ماصة آبار المقابلة من Ab-حبة لوحة معقدة أبقى على الجليد والمزيج بلطف 15 مرة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. ختم اللوحة جيدا مع ألومنيوم لوحة الغطاء واحتضان بين عشية وضحاها (12-18 ح) في 4 درجات مئوية على منصة الدورية. إعادة تسمية لوحة رد فعل “الملكية الفكرية”. 3-يوم 2: ندتشيب-seq يغسل وشطف تعيين خلاط التدفئة إلى 65 درجة مئوية. على الجليد، إعداد المخزن المؤقت منخفضة الملح يغسل ويغسل الملح عالية المخزن المؤقت. الدوران السريع لوحة رد فعل IP من الخطوة 2.4.3 لمدة 10 ثانية في 200 x ز. ضع لوحة رد فعل الملكية الفكرية على لوحة مغناطيس وانتظر 15 ثانية للحل لتصبح واضحة. باستخدام الأقنية ماصة، دون الإخلال بالخرز، إزالة بعناية وتجاهل المادة طافية. اللوحة قبالة لوحة المغناطيس ووضعه على الجليد. لكل صف من العينات في لوحة رد فعل الملكية الفكرية، إضافة 150 ميليلتر من الملح المنخفض المثلج يغسل المخزن المؤقت والمزيج ببطء 10 مرات صعودا وهبوطاً الكامل ريسوسبيند الخرز. ضع لوحة رد فعل IP مرة أخرى على لوحة المغناطيس، انتظر الخرز لفصل، واستخدام ماصة متعددة القنوات، دون الإخلال بالخرز إزالة وتجاهل المادة طافية. ضع اللوحة مرة أخرى على الجليد وكرر الخطوتين 3.1.3 و 3.1.4 لإجمالي يغسل 2. على الجليد، لكل صف من العينات في لوحة رد فعل الملكية الفكرية، إضافة 150 ميليلتر من الملح عالية تغسل المخزن المؤقت والمزيج ببطء 10 مرات من بيبيتينج صعودا وهبوطاً الكامل ريسوسبيند الخرز. ضع لوحة رد فعل IP مرة أخرى على لوحة المغناطيس، انتظر الخرز لفصل، واستخدام ماصة متعددة القنوات، دون الإخلال بالخرز إزالة وتجاهل المادة طافية. وضع لوحة رد فعل الملكية الفكرية على الجليد والبرد قبل صفيحة 96-بئر جديدة بجانبه. لكل صف من العينات في لوحة رد فعل الملكية الفكرية، إضافة 150 ميليلتر من الملح عالية تغسل المخزن المؤقت والمزيج ببطء 10 مرات من بيبيتينج صعودا وهبوطاً الكامل ريسوسبيند الخرز. بعد استثارة، نقل كل صف من العينات إلى الصف المطابق للوحة جديدة، مبردة مسبقاً، 96-جيدا. قم بتسمية اللوحة رد فعل “الملكية الفكرية”. تجاهل لوحة قديمة. ضع لوحة رد فعل الملكية الفكرية الجديدة على لوحة المغناطيس وانتظر الخرز لفصل. باستخدام الأقنية ماصة، دون الإخلال بالخرز، إزالة بعناية وتجاهل المادة طافية. تبقى اللوحة في درجة حرارة الغرفة. لكل صف من العينات في لوحة رد فعل الملكية الفكرية، إضافة 30 ميليلتر من المخزن المؤقت شطف رقاقة (المجلس التنفيذي) وتخلط ببطء 10 مرات من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تأكد من منع تكوين فقاعة. ختم اللوحة جيدا مع تغطية بكر واحتضان في خلاط تدفئة في 65 درجة مئوية ل 1.5 ح بسرعة خلط 1,350 لفة في الدقيقة. بعد 1.5 ح الحاضنات، تدور أسفل لوحة رد فعل الملكية الفكرية في 200 غ س ل 1 دقيقة في 4 درجات مئوية. تغيير إعداد خلاط التدفئة إلى 50 درجة مئوية. بعد تدور، مكان لوحة رد فعل الملكية الفكرية عن مغناطيس لوحة والانتظار لحل واضح. استخدام ماصة متعددة القنوات، دون الإخلال بالخرز، بعناية نقل 30 ميليلتر من المادة طافية في لوحة 96-بئر جديدة. استخدام تلميحات جديدة لكل صف. تسمية اللوحة رد فعل “الملكية الفكرية” والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة. هضم البروتين استرداد 30% “كلوريد الصوديوم م” الوتد/1 حبة المغناطيسي17 (الجدول تكوين المخزن المؤقت) الحل من الثلاجة 4 درجات مئوية ويبقيه في درجة حرارة الغرفة على الأقل 30 دقيقة حرجة: التأكد من أن الحل حبة كاملة تصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة. استرداد عنصر تحكم الإدخال عينات من تخزين 4 درجة مئوية (الخطوة 2.3.2) والدوران السريع. قياس حجم استخدام ماصة وإضافة الماء عالي النقاوة إلى كل عنصر تحكم الإدخال لنقل وحدة تخزين نهائي من 30 ميليلتر. عينات مراقبة المدخلات إلى الآبار الإدخال المحدد مسبقاً (الآبار فارغة) في لوحة رد فعل الملكية الفكرية (الخطوة 3.1.12). سجل البئر إلى مفتاح عينة. على الجليد، إعداد مزيج البروتين الهضم الرئيسية كما هو مبين في الجدول 5 وحجم تساوي الكوة في صف واحد من لوحة خزان 96-جيدا. استخدام ماصة متعددة القنوات، لكل صف من العينات في لوحة رد فعل الملكية الفكرية، إضافة 40 ميليلتر من مزيج ماجستير هضم البروتين ومزيج ببطء 10 مرات صعودا وهبوطاً. ختم اللوحة جيدا مع تغطية بكر وتدور إلى أسفل في 200 غ س ل 1 دقيقة واحتضان في خلاط تدفئة عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تعيين 650 لفة في الدقيقة. بينما هو حضانة اللوحة، إعداد جديدة 70% إيثانول (EtOH) والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة. بعد الانتهاء من حضانة و 30 دقيقة، تدور لوحة رد فعل الملكية الفكرية في 200 غ س ل 1 دقيقة، 4 درجة مئوية. تبقى اللوحة في درجة حرارة الغرفة.ملاحظة: مجموع حجم ينبغي أن يكون الآن ~ 70 ميليلتر/جيدا. حبة تنظيف استخدام محلول حبة المغناطيسي الوتد/1 “م كلوريد الصوديوم” 30% الكوة درجة حرارة الغرفة 30% من الوتد/1 “م كلوريد الصوديوم” المغناطيسي حبة الحل في صف واحد من صفيحة الخزان نظيف 96-جيدا (ميليلتر 75 كل عينة x # الصفوف). تعمل في درجة حرارة الغرفة، باستخدام الأقنية ماصة، إضافة 70 ميليلتر (نسبة 1:1) للحل حبة المغناطيسي الوتد/1 “م كلوريد الصوديوم” 30% لكل صف من العينات في لوحة رد فعل الملكية الفكرية وخلط 10 مرات من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تغيير نصائح بين الصفوف. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضع اللوحة في لوحة المغناطيس واحتضان لمدة 5 دقائق للسماح الخرز لفصل. استخدام ماصة، دون الإخلال بالخرز، إزالة بعناية وتجاهل المادة طافية. الاحتفاظ بالخرز. بينما لوحة رد فعل الملكية الفكرية لا يزال على لوحة المغناطيس، استخدام ماصة متعددة القنوات، لكل صف من العينات، وإضافة 150 ميليلتر من درجة حرارة الغرفة 70% EtOH واحتضان لمدة 30 ثانية. وبعد 30 ثانية، استخدام الأقنية ماصة، إزالة وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى ليصبح مجموع يغسل 2. بعد الغسيل EtOH الثانية، احتضان لوحة ‘جافة’ على لوحة المغناطيس لتفتيش دقيقة 3 بصريا لوحة للتأكد من أن جميع EtOH يتبخر. إذا لم يكن الأمر كذلك، احتضان لوحة للحد الأدنى 1 الإفراط تجفيف حبات النتائج في انخفاض عائد. تأخذ اللوحة قبالة لوحة المغناطيس واستخدام الأقنية ماصة، إضافة 35 ميليلتر EB (جدول المواد). مزيج جيد من قبل بيبيتينج 10 مرات صعودا وهبوطاً. تغيير نصائح بين الصفوف. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق الوتي. بعد الحضانة، ضع لوحة رد فعل IP مرة أخرى على لوحة المغناطيس واحتضان لمدة 2 دقيقة. وينبغي فصل الخرز والحل سوف تصبح واضحة. استخدام ماصة متعددة القنوات، دون الإخلال بالخرز، بعناية نقل المادة طافية في الآبار المقابلة للوحة 96-بئر جديدة. ختم لوحة الغطاء لوحة ألومنيوم، وتسمية “البرنامج + إدخال الحمض النووي”، وتخزين في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها، أو في-20 درجة مئوية لمدة طويلة (> ح 48) التخزين. 4-اليوم الثالث: بناء المكتبة الإصلاح نهاية والفسفره الإدخال لرد فعل نهاية إصلاح/الفسفرة هي البرنامج + إدخال لوحة من الخطوة 3.3.10. بعد ذوبان الجليد، تدور اللوحة إلى أسفل في 200 غ س ل 1 دقيقة في 4 درجات مئوية وتبقى على الجليد. استرداد من-20 درجة مئوية المجمد كل من الكواشف (ما عدا الإنزيمات) اللازمة لرد فعل نهاية إصلاح/الفسفرة (الجدول 6) وذوبان الجليد لهم في درجة حرارة الغرفة، ثم نقل على الفور الجليد. وتعمل على الجليد، اتبع الجدول 6 لإعداد مزيج نهاية إصلاح/الفسفرة ماجستير في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل عقيمة،. بعد إضافة كافة المكونات غير إنزيم، مزيج جيد من قبل فورتيكسينج نبض ووضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد. استرداد الإنزيمات ذات الصلة من التخزين المبرد والنقل إلى مقاعد البدلاء في رف باردة مبردة أنبوبة. مزج كل إنزيم بالتحريك أنبوب، وتدور سريعة، وطرأت على الرف باردة مبردة أنبوب. عندما بيبيتينج الإنزيم، نضح ببطء لضمان نقل صورة دقيقة حجم. بعد الإضافة، يغسل التلميح في مزيج الرئيسي من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. حالما تتم إضافة الإنزيمات، بلطف نبض-دوامة مزيج الرئيسي 5 مرات لأؤكد توزيعاً حتى لجميع المكونات، ثم تدور سريعاً وفورا بوضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد. على الجليد، وقاسمه وحدة تخزين مناسبة من خليط نهاية إصلاح/الفسفرة ماجستير في صف واحد من لوحة خزان 96-بئر جديدة؛ وحدة التخزين ليتم الكوتيد: (ميليلتر 15 × # الصفوف) + 5 ميليلتر حجم القتلى. حساب مثال لصفين: (15 ميليلتر x 2) + 5 ميليلتر = 35 ميليلتر/جيدا. استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 15 ميليلتر من مزيج الرئيسي إصلاح/الفسفرة نهاية لكل صف من عينات وخلط 10 مرات من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تغيير نصائح بين الصفوف. ختم اللوحة بغطاء بلاستيكي وتدور إلى أسفل في 200 غ س ل 1 دقيقة في 4 درجات مئوية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. حبة تنظيف بعد نهاية الإصلاح والفسفره من الثلاجة 4 درجات مئوية، استرداد 20% “كلوريد الصوديوم م” الوتد/1 حبة المغناطيسية الحل والحل الوتد/1 “م كلوريد الصوديوم” 30% واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل.ملاحظة: الحل الوتد/1 “م كلوريد الصوديوم” 30% لا تحتوي على حبات مغناطيسية. بعد كل الحلول إلى درجة حرارة الغرفة، لكل عينة إعداد ميليلتر 80 من مزيج من 1:2 من 30% الوتد/1 “م كلوريد الصوديوم” و 20% “كلوريد الصوديوم م” الوتد/1 حبة المغناطيسي الحلول. مثال للعينات 24: ميليلتر 80 × 24 = 1,920 ميليلتر (640 ميليلتر من 30% الوتد/1 “م كلوريد الصوديوم” وميليلتر 1,288 الحلول حبة المغناطيسي الوتد/1 “م كلوريد الصوديوم” 20%). اليكووت الحل حبة مزيج، متساوية الحجم، في صف واحد من لوحة خزان 96-جيدا والحفاظ عليه في درجة حرارة الغرفة. الكوة EB العازلة (40 ميكروليتر كل عينة x # الصفوف) في صف واحد من صفيحة الخزان نظيف 96-جيدا. مثال لصفين: ميليلتر 40 × 2 = 80 ميكروليتر/جيدا. استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة ميليلتر 75 من هذا المزيج حبة أعدت في خطوة 4-2-2 في كل صف من عينات من الخطوة 4.1.7 ومزيج صعودا وهبوطاً 10 مرات. تغيير نصائح بين الصفوف. احتضان في درجة حرارة الغرفة ل 15 دقيقة متابعة مع إجراء تنظيف حبة كما هو موضح في الخطوات 3.3.3-3.3.10. تغطية اللوحة مع ختم بلاستيك، تدور سريعاً ووضعه على الجليد. انتقل إلى الخطوة 4، 3. أ-تراجع رد الفعل استرداد من الثلاجة-20 درجة مئوية كل من الكواشف (ما عدا الإنزيمات) المطلوبة لرد الفعل بتراجع (الجدول 7)، وذوبان الجليد لهم في درجة حرارة الغرفة ثم نقل على الفور الجليد. وتعمل على الجليد، اتبع الجدول 7 لإعداد “مزيج الرئيسي” A-تراجع في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل عقيمة،. اتبع إرشادات الإعداد المشروب الانزيمية العامة كما هو موضح في الخطوات 4.1.4-4.1.6. استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 15 ميليلتر من “مزيج الرئيسي” A-تراجع لكل صف من عينات وخلط 10 مرات من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تغيير نصائح بين الصفوف. ختم اللوحة مع غطاء بكر وتدور إلى أسفل في 200 غ س ل 1 دقيقة في 4 درجات مئوية، واحتضان في ثيرموسيكلير عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وبعد الحضانة، تدور اللوحة إلى أسفل في 200 غ س ل 1 دقيقة ويبقيه في درجة حرارة الغرفة. حبة تنظيف بعد تراجع A تنفيذ الخطوات الموضحة في الخطوة 4، 2. تغطية اللوحة مع ختم بلاستيك، تسمية “ذيل A + قبل الميلاد”، تدور سريعة، ووضعه على الجليد. انتقل إلى الخطوة 4، 5. ربط محول استرداد من الثلاجة-20 درجة مئوية كل من الكواشف (ما عدا الإنزيمات) المطلوبة لرد الفعل ربط محول (الجدول 8)، وذوبان الجليد لهم في درجة حرارة الغرفة ثم نقل على الفور الجليد. استرداد 10 ميكرون PE محول (تكميلية الجدول 1) حل الأسهم وتضعف إلى 0.5 ميكرومتر استخدام EB. مزيج جيد من قبل نبض فورتيكسينج. وحدة التخزين المطلوب هو ميليلتر 3 × # العينات. وتعمل على الجليد، اليكووت المحول 0.5 ميكرومتر PE، متساوية الحجم، إلى 12 بئرا من صفيحة الخزان نظيف 96-جيدا. يبقيه على الجليد. وتعمل على الجليد، اتبع الجدول 8 لإعداد مزيج الرئيسي ربط محول في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل عقيمة،. اتبع إرشادات الإعداد المشروب الانزيمية العامة كما هو موضح في الخطوات 4.1.4-4.1.6. تأكد من أن 5 X سريعة ربط المخزن المؤقت تماما المذابة والمختلطة جيدا قبل الاستخدام. على الجليد، قاسمة بحجم المزيج الرئيسي ربط محول إلى صف واحد من لوحة خزان 96-بئر جديدة مناسبة. على سبيل المثال، حساب صفوف اثنين: (23 ميليلتر x 2) + 5 ميليلتر = 51 ميليلتر/جيدا. تبقى لوحة على الجليد. باستخدام الأقنية ماصة، إضافة 2 ميليلتر من ميكرومتر 0.5 محول نهاية الاقتران (PE) في كل صف من عينات من الخطوة 4.4.1 ومزيج. تغيير نصائح بين الصفوف. استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 23 ميليلتر من مزيج الرئيسي ربط محول لكل صف من عينات ومزيج مرات 15 من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تغيير نصائح بين الصفوف. إغلاق لوحة الغطاء معدني، تسمية “ربط”، تدور إلى أسفل في 200 غ س ل 1 دقيقة في 4 درجات مئوية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. يوم 4: حبة تنظيف #1 بعد ربط محول من الثلاجة 4 درجات مئوية، استرداد الحل حبة المغناطيسي الوتد/1 “م كلوريد الصوديوم” 20% واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. في حين أن الحل هو اكويليبراتينج إعداد جديدة 70% EtOH. قاسمة الحل حبة المغناطيسي الوتد/1 “م كلوريد الصوديوم” 20%، ميليلتر 55 كل عينة، في صف واحد من خزان 96-جيدا لوحة ويبقيه في درجة حرارة الغرفة. مثال لصفين: ميليلتر 55 × 2 = 110 ميليلتر/جيدا. المخزن المؤقت EB الكوة، 50 ميليلتر كل عينة، في صف واحد من صفيحة الخزان نظيف 96-جيدا. مثال لصفين: ميليلتر 50 × 2 = 100 ميليلتر/جيدا. استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 48 ميليلتر من الحل حبة المغناطيسي الوتد/1 “م كلوريد الصوديوم” 20% في كل صف من العينات في لوحة ربط من الخطوة 4.5.6 ومزيج صعودا وهبوطاً 10 مرات. تغيير نصائح بين الصفوف. احتضان في درجة حرارة الغرفة ل 15 دقيقة متابعة مع إجراء تنظيف حبة كما هو موضح في الخطوات 3.3.3-3.3.7. تأخذ اللوحة قبالة لوحة المغناطيس واستخدام الأقنية ماصة، إضافة ميليلتر 45 EB (جدول المواد). مزيج جيد من قبل بيبيتينج 10 مرات صعودا وهبوطاً. تغيير نصائح بين الصفوف. احتضانها لدرجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق الوت. بعد الحضانة، ضع لوحة رد فعل الملكية الفكرية يعيدوه المغناطيس لوحة واحتضانها للحد الأدنى 2 باستخدام الأقنية ماصة، دون الإخلال بالخرز، ونقل المادة طافية بعناية في الآبار المقابلة للوحة 96-بئر جديدة. تسمية اللوحة “ربط + 1 قبل الميلاد”. لكل بئر إضافة 5 ميليلتر من 10 العازلة عالية الدقة x PCR ومزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تغيير نصائح بين الصفوف. تغطية اللوحة مع ختم بلاستيك، تدور سريعة، ويبقيه في درجة حرارة الغرفة. حبة تنظيف #2 بعد ربط محول تنفيذ تنظيف حبة كما هو موضح في القسم 4.6 مع التغييرات التالية: إضافة 60 ميليلتر من حل حبة المغناطيسي الوتد/1 “م كلوريد الصوديوم” 20% لكل بئر النشطة في عملية ربط + 01:00 م لوحة (الخطوة 4.6.7) والوتي من الخرز استخدام 35 ميليلتر من المخزن المؤقت للمجلس التنفيذي. تسمية اللوحة “ربط + 2 قبل الميلاد” وإبقائه على الجليد. [بكر] تضخيم استرداد كافة الكواشف (ما عدا الإنزيمات) اللازمة لتفاعل PCR (الجدول 9) من الثلاجة-20 درجة مئوية، وذوبان الجليد لهم في درجة حرارة الغرفة ثم وضعها مباشرة على الجليد. وتعمل على الجليد، اتبع الجدول 9 لإعداد مزيج PCR ماجستير في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل عقيمة،. اتبع الإرشادات إعداد المشروب العامة كما هو موضح في الخطوات 4.1.4-4.1.5. على الجليد، قاسمة وحدة تخزين مناسبة من خليط سيد بكر في صف واحد من لوحة خزان 96-بئر جديدة. يبقيه على الجليد. راجع الخطوة 4.5.4 لحسابات عينة. تعمل على الجليد، استخدام الأقنية ماصة، إضافة 2 ميليلتر من كل مكم 12.5 فريدة بكر عكس الفهرسة التمهيدي (تكميلية الجدول 2) في كل بئر الربط + لوحة 2 قبل الميلاد (الخطوة 4.7.1) وتخلط ببطء صعودا وهبوطاً. تغيير نصائح بين الصفوف. تبقى لوحة على الجليد. إضافة العامل على الجليد، استخدام الأقنية ماصة، 23 ميليلتر من مزيج PCR الرئيسي في كل صف من عينات من الخطوة 4.8.3 ومزيج 10 مرات من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. ختم اللوحة مع غطاء بكر وأنها تدور إلى أسفل في 200 غ س ل 1 دقيقة واحتضان في ثيرموسيكلير (انظر الجدول 10 لظروف ركوب PCR). حبة تنظيف بعد التضخيم بكر بعد [بكر] تضخيم تدور اللوحة في 200 غ س ل 1 دقيقة، 4 درجة مئوية. تنفيذ تنظيف حبة كما هو موضح في القسم 4.6 مع التغييرات التالية: إضافة ميليلتر 51 من 20% “كلوريد الصوديوم م” الوتد/1 حبة المغناطيسية الحل لكل تفاعل PCR والوتي من الخرز باستخدام 25 ميليلتر من المخزن المؤقت للمجلس التنفيذي. ختم اللوحة مع غطاء ألومنيوم وتدور إلى أسفل في ز 200 x لمخزن 1 دقيقة العينات من-20 درجة مئوية. للتحقق من صحة بناء المكتبات، إجراء القياس الكمي الحمض النووي باستخدام تحليل القائم على الأسفار وتصور المنتج النهائي استخدام محلل التفريد شعرية القائم على رقاقة (تحليل حساسية عالية) وتشغيل تخصيب PCR الكمي (qPCR) (انظر النتائج ممثلة، التحقق نوعية المكتبة seq ندتشيب من قبكر).
Representative Results
التشكيلات الجانبية الهضم الكروماتينالأمثل لهضم منسى أمر أساسي لنجاح هذا البروتوكول. من الأهمية بمكان لإنشاء ملف تعريف هضم تهيمن أحجام يفتت nucleosome واحد، في حين لا هضمها الإفراط، للسماح لانتعاش شظايا nucleosome ترتيب أعلى. ملف تعريف هضم مثالي يتكون من أغلبية شظايا nucleosome واحد مع جزء صغير يمثل أجزاء أصغر وأكبر من nucleosomes واحد. ويبين الشكل 1 أمثلة التشكيلات الجانبية لتوزيع حجم مثالي وهضمها الإفراط، ويهضم تحت. لاحظ أيضا أن الهضم دون المستوى الأمثل من الكروماتين الظاهر في التشكيل الجانبي لتسلسل المكتبة التي تم إنشاؤها من مواد الملكية الفكرية (الشكل 2). التحقق من “جودة مكتبة” seq ندتشيب من قبكرقبكر وسيلة راسخة لتقييم نوعية رقاقة18،،من1920. عندما يؤدون seq ندتشيب على 10000 خلايا عائد الحمض النووي بعد الملكية الفكرية سوف يكون أقل من 1 نانوغرام. ولذلك، من الضروري إجراء qPCR بعد بناء مكتبة لتقييم الإثراء النسبي للمناطق المستهدفة على خلفية. تقديم تقدير خلفية، يتم إنشاء المكتبات التي شيدت من الكروماتين مناسى هضمها (مدخلات). لكل مكتبة الملكية الفكرية، هناك حاجة إلى مجموعتين من الإشعال (انظر التكميليةالجدول 3 للحصول على قائمة من كبسولة تفجير لعلامات هيستون استخداماً). ينبغي أن تكون مجموعة التمهيدي واحدة محددة لمنطقة الجينوم الذي يقترن دائماً هستون تعديل الفائدة (الإيجابية المستهدفة)، والمنطقة الأخرى التي لم يتم وضع علامة مع هستون تعديل الفائدة (الهدف السلبي). سيتم تقييم نوعية المكتبة seq رقاقة كما اثنِ تخصيب اليورانيوم فيما يتعلق بمكتبة الإدخال. تخصيب إضعاف يمكن أن تحسب باستخدام المعادلة التالية التي يفترض التضخيم الهائل من المنطقة المستهدفة الجينوم: 2قيراطالإدخال-Ctالملكية الفكرية. عادتنا بحزمة البرامج الإحصائية R، qcQpcr_v1.2، مناسبة لتحليل تخصيب qPCR منخفضة الإدخال الأصلي seq رقاقة مكتبات (ملفات التعليمات البرمجية الإضافية). الشكل 3 يمثل نتيجة qPCR لمكتبات seq رقاقة الناجحة وغير الناجحة. قيمة الإثراء إضعاف الحد الأدنى المتوقع للمكتبات ندتشيب-seq النوعية الجيدة هي 16 لعلامات الضيقة، مثل H3K4me3، و 7 لعلامات واسع النطاق، وعلى سبيل المثال H3K27me3. الوصول مناسى النمذجةالتحليل الحسابي لرقاقة seq معقدة وفريدة من نوعها لكل الإعداد التجريبية. يمكن استخدام مجموعة من المبادئ التوجيهية التي وضعها اتحاد ابيجينوميك الدولي الإنسان (المفوضية) والموسوعة من عناصر الحمض النووي (ترميز) لتقييم نوعية المكتبات seq رقاقة21. من المهم ملاحظة أن عمق التسلسل من المكتبات يؤثر على كشف وحل المناطق المخصب20. تم الكشف عن زيادة عدد القمم ونهج هضبة كما يزيد من عمق القراءة. نوصي بمكتبات seq ندتشيب تكون متسلسلة وفقا لتوصيات المفوضية العليا المستقلة 50 مليون إقران-القراءات (شظايا 25 مليون) لعلامات الضيق (مثلاً، H3K4me3) و 100 مليون إقران-ما يلي: (50 مليون الشظايا) لعلامات عريضة ( مثل، H3K27me3) وإدخال22. توفر هذه الأعماق تسلسل التحالفات تسلسل كافية للكشف عن أهم قمم تستخدم على نطاق واسع استخدام رقاقة seq ذروة المتصلين، مثل MACS2 وهوميروس، دون الوصول إلى التشبع،من2324. مكتبة seq ندتشيب الثدييات ذات جودة عالية، بمعدل تكرار بكر 90% (بما في ذلك ما يلي المكررة). سوف تحتوي على مكتبات seq ندتشيب الناجح replicates عالية مرتبطة مع جزء كبير من قمم يقرأ الانحياز داخل MACS222 حددت المخصب (> 40%)، وينبغي أن تكشف عن تفتيش القراءات المنحازة في مستعرض جينوم بصريا الفاسدون لا يمكن اكتشافها بالمقارنة إلى مكتبة الإدخال (الشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام seq ندتشيب لتقييم كثافة نوكليوسومي باستخدام خوارزمية توزيع خليط ضبابي (ث1 * n(x؛ Μ 1،σ1) + w2 * n(x؛ μ2، σ2) = 1) في MACS2 تحديد مناطق المخصب إلى نموذج nucleosome الكثافة حسب تعريف حدود منسى موجوداً. في هذا النموذج، ث1 يمثل توزيع مونو-نوكليوسومي الوزن ويمثل ث2 دي-نوكليوسومي توزيع الوزن. في حالة أكبر من ث2ث1 ، هناك هيمنة الشظايا مونو-نوكليوسومي والعكس بالعكس. ويتطلب هذا التحليل أن المكتبات تكون متسلسلة بطريقة نهاية الاقتران حيث أنه يمكن تعريف أحجام يفتت. بغية تطبيق الخوارزمية توزيع خليط ضبابي، أولاً يتم تحديد مناطق المخصب يعتد به إحصائيا. ونحن نقترح الدعوة ذروتها مع MACS2 استخدام الإدخال كعنصر تحكم ومع الإعدادات الافتراضية لعلامات الضيق وقطع قيمة q 0.01 لعلامات عريضة. يتوفر عدد من الحزم الإحصائية تستخدم خوارزمية توزيع غاوسي خليط من حزم البرامج الإحصائية المستخدمة على نطاق واسع. استخدام جزء متوسط الحجم، تحدد بحدود نهاية إقران قراءة عينات البرنامج، توزيعات في MACS2 تحديد المروجين المخصب، وخوارزميه توزيع خليط ضبابي يمكن تطبيقها على كل المروج باستخدام الحزمة الإحصائية-R مكلوست الإصدار 3.025 لحساب توزيع مرجح. في هذا التطبيق، نوصي بإزالة المروجين تحتوي على شظايا الانحياز أقل من 30 لأن هذه العتبة الوزن الناتجة تصبح تقديرات لا يمكن الاعتماد عليها. مكتبة ندتشيب-seq نوعية جيدة يولد توزيع خليط غاوسي التي تتكون من عنصرين رئيسيين مع متوسط القيم المقابلة لأحادية الطور، أطوال جزء دي-نوكليوسومي. الشكل 1 : تقييم هضم منسى قبل مكتبة الجيل- التفريد الشعرية القائم على رقاقة محلل لمحات من منسى الأمثل هضمها (A)، وتحت هضمها (ب)، والإفراط يهضم الكروماتين (ج). وترد replicates البيولوجية كآثار الأحمر والأزرق والأخضر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2 : تقييم هضم منسى بعد جيل المكتبة. (A) آخر التشكيلات الجانبية لبناء مكتبة من مدخلات هضمها على النحو الأمثل (replicates البيولوجية؛ والأحمر، الأخضر، والأسود) والملكية الفكرية (replicates البيولوجية؛ والسماوي، الأرجواني، والأزرق) والمدخلات (ب) دون المستوى الأمثل (replicates البيولوجية؛ والأحمر، الأخضر، والأزرق) والملكية الفكرية ( replicates البيولوجية؛ مكتبات السماوي، والأرجواني، والبرتقالي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3 : مرحلة ما بعد البناء مكتبة PCR الكمي يمكن استخدامها لتقييم نوعية المكتبات seq ندتشيب. يحسب حظيرة إثراء المكتبات H3K4me3 الملكية الفكرية فيما يتعلق بمكتبات الإدخال ك 2(الأشعة المقطعية للإدخال-التصوير المقطعي للملكية الفكرية) للأهداف الإيجابية والسلبية باستخدام qcQpcr_v1.2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4 : مكتبة seq ندتشيب الممثل شيدت من 10,000 CD34 الأولية+ الحبل خلايا الدم. ارتباط بيرسون H3K4me3 إشارة (قراءة كل القراءات المعينة مليون) تحسب في المروجين (خدمات الدعم التقني–/+ 2 كيلو بايت) بين 3 replicates البيولوجية، وتكرار (A) 1 و 2 (ب) تكرار 1 و 3 (ج) تكرار 2 و 3. (د) التسخن المستعرض عرض مجموعة الجينات هوكسا seq رقاقة cross-linked المتولدة من الخلايا 1 مليون كل الملكية الفكرية و seq ندتشيب ناجحة من الخلايا 10,000 في مجال الملكية الفكرية و seq ندتشيب فاشلة من الخلايا 10,000 في مجال الملكية الفكرية. (الأحمر: H3K27me3، الأخضر: H3K4me3، والأسود: الإدخال). (ﻫ) جزء من القراءات المعينة داخل MACS2 حددت مناطق المخصب H3K4me3 (أسود) و H3K27me3 (رمادي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- تكوين المخزن المؤقت ألف-1-إيمونوبريسيبيتيشن المخزن المؤقت (IP) 20 مم تريس-HCl درجة الحموضة 7.5 2 مم يدتا 150 مم كلوريد الصوديوم 0.1 X-100 تريتون % 0.1% ديوكسيتشولاتي بوتيرات الصوديوم 10 ملم ألف-2-“منخفض الملح يغسل” المخزن المؤقت 20 مم تريس-HCl pH 8.0 2 مم يدتا 150 مم كلوريد الصوديوم 1% Triton X-100 0.1 الحزب الديمقراطي الصربي % ألف-3-“يغسل الملح عالية” المخزن المؤقت 20 مم تريس-HCl pH 8.0 2 مم يدتا 500 ملم كلوريد الصوديوم 1% Triton X-100 0.1 الحزب الديمقراطي الصربي % ألف-4-“شطف الرقائق” العازلة 100 مم ناكو3 الحزب الديمقراطي الصربي 1% ألف-5-1 × تحلل المخزن المؤقت – 1 مل 0.1% تريتون 0.1% ديوكسيتشولاتي بوتيرات الصوديوم 10 ملم ألف-6-Ab تمييع المخزن المؤقت 0.05% (w/v) أزيد 0.05% واسعة الطيف مضادات الميكروبات (مثل بروكلين 300) في برنامج تلفزيوني ألف-7-30% الوتد/1 م “محلول كلوريد الصوديوم حبة المغناطيسية” (مرجع16) ربط 30% كلوريد الصوديوم م 1 10 ملم HCl تريس درجة الحموضة 7.5 1 مم يدتا 1 مل من غسلها الخرز سوبر باراماجنيتيك ألف – 8-20% الوتد/1 م “محلول كلوريد الصوديوم حبة المغناطيسية” (مرجع16) ربط 30% كلوريد الصوديوم م 1 10 ملم HCl تريس درجة الحموضة 7.5 1 مم يدتا 1 مل من غسلها الخرز سوبر باراماجنيتيك الجدول 1: تكوين seq ندتشيب المخزن المؤقت. تعديل هيستون تركيز (ميكروغرام/ميليلتر) H3K4me3 0.125 H3K4me1 0.25 H3K27me3 0.125 H3K9me3 0.125 H3K36me3 0.125 H3K27ac 0.125 الجدول 2: جسم المبلغ المطلوب لما يليها ندتشيب ريجانيت وحدة التخزين (ميليلتر) مياه نقية جداً 478 1 م تريس-HCl pH 7.5 10 0.5 يدتا م 10 كلوريد الصوديوم 5 م 2 الجلسرين 500 الحجم الإجمالي 1,000 الجدول 3: وصفه للمخزن المؤقت لتمييع منسى. كاشف وحدة التخزين (ميليلتر) مياه نقية جداً 13 20 مم DTT 1 10 × منسى المخزن المؤقت 4 20 ش/ميليلتر منسى 2 الحجم الإجمالي 20 الجدول 4: وصفه لمزيج سيد منسى. كاشف وحدة التخزين (ميليلتر) شطف المخزن المؤقت 30 المخزن المؤقت G2 8 البروتياز 2 الحجم الإجمالي 40 الجدول 5: وصفه لمزيج ماجستير تنقية الحمض النووي. كاشف وحدة التخزين (ميليلتر) مياه نقية جداً 3.3 10 × Endonuclease تقييد المخزن المؤقت (مثل نيبوفير) 5 25 مم ATP 2 دنتبس 10 ملم 2 T4 بولينوكليوتيدي كيناز (يو 10/ميليلتر) 1 بوليميراز الدنا T4 (يو 3/ميليلتر) 1.5 بوليميراز الدنا الأول، جزء كبير (كلينوو) (يو 5/ميليلتر) 0.2 الحجم الإجمالي 15 الجدول 6: وصفه لمزيج نهاية الإصلاح الرئيسية. كاشف وحدة التخزين (ميليلتر) مياه نقية جداً 8 10 × Endonuclease تقييد المخزن المؤقت (مثل نيبوفير) 5 داتب 10 ملم 1 كلينوو (3 ‘-5’ أكسو-) 1 الحجم الإجمالي 15 الجدول 7: وصفه لمزيج الرئيسي A-تراجع. كاشف وحدة التخزين (ميليلتر) مياه نقية جداً 4.3 5 x المخزن المؤقت لربط سريع 12 ليجاسى T4 الحمض النووي (2000 يو/ميليلتر) 6.7 الحجم الإجمالي 23 الجدول 8: وصفه لمزيج الرئيسي ربط المحول. كاشف وحدة التخزين (ميليلتر) مياه نقية جداً 7 25 أم بكر التمهيدي 1.0 2 5 x التردد المخزن المؤقت 12 [دمس] 1.5 بوليميراز الدنا 0.5 الحجم الإجمالي 23 الجدول 9: وصفه لمزيج ماجستير PCR. درجة الحرارة (درجة مئوية) المدة (s) عدد الدورات 98 60 1 98 30 65 15 10 72 15 72 300 1 4 عقد عقد الجدول 10: بكر تشغيل الأسلوب. اليغو التسلسل التعديل PE_adapter 1 5-/5Phos/جات وظفته AAG AGC الكبد TCA الائتلاف GGA ATG سی AG-3 ‘ 5 ‘ التعديل: الفسفرة PE_adapter 2 5 ‘-هيئة مكافحة الفساد مكافحة الإرهاب TTT CCC ACG تاك ACG لجنة مكافحة الإرهاب عقاري CGA TC * تي-3’ 3 ‘ التعديل: * T سند فوسفوروثيواتي تكميلية الجدول 1: تسلسلات اليغو لجيل محول PE. اسم الدليل التسلسل فهرس إينديكسريفك (لاستخدامها للتسلسل) بكر عكس الفهرسة التمهيدي 1 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكجتجاتكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت كجتجات أتكاكج بكر عكس الفهرسة التمهيدي 2 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكتجاتككجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت كتجاتك جاتكاج بكر عكس الفهرسة التمهيدي 3 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجججتكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت جججت أعكككك بكر عكس الفهرسة التمهيدي 4 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكتججتكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت كتجتت أكككاج بكر عكس الفهرسة التمهيدي 5 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاجكجكتكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت أجكجكت أجكجكت بكر عكس الفهرسة التمهيدي 6 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكتتتجكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت كتتتتج كاااج بكر عكس الفهرسة التمهيدي 7 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجتجكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت تجتتج ككاكا بكر عكس الفهرسة التمهيدي 8 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاجكتاجكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت أجكتاج كتاجكت بكر عكس الفهرسة التمهيدي 9 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاجكاتككجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت أجكاتك جاتجكت بكر عكس الفهرسة التمهيدي 10 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكجاتاكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت كجاتا تاتكج بكر عكس الفهرسة التمهيدي 11 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتكاكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت كاتكا تجاتج بكر عكس الفهرسة التمهيدي 12 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجاكتكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت جاكت أجتتكك بكر عكس التمهيدي الفهرسة 13 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاكاتكجكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت أكاتكج كجاتجت بكر عكس الفهرسة التمهيدي 14 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاجكتاكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت آجكتا تاجكت بكر عكس الفهرسة التمهيدي 15 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكاجتكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت كاجت آكتتج بكر عكس التمهيدي الفهرسة 16 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجككجتكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت جككجت أككجك بكر عكس الفهرسة التمهيدي 17 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكجككتكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت كجككت أجككج بكر عكس التمهيدي الفهرسة 18 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاجتجكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت تاجتج كاكِتا بكر عكس التمهيدي الفهرسة 19 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجكجتجكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت جكجتج ككاكجك بكر عكس التمهيدي الفهرسة 20 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجتاتاجكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت جتاتاج كتاتاك بكر عكس التمهيدي الفهرسة 21 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتككتجككجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت ككتجك جكاج بكر عكس التمهيدي الفهرسة 22 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجكتجتاكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت جكتجتا تاكاجك بكر عكس التمهيدي الفهرسة 23 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاتجكاكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت أتجكا تجككات بكر عكس التمهيدي الفهرسة 24 كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجاكاتكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت تجاكات أتجتكا تكميلية الجدول 2: عكس بكر الفهرسة متواليات التمهيدي. كبسولة تفجير التسلسل ZNF333_genic_H3K9me3_F –أجككتكاتكاجككاتكاتكككت 5 ‘-3’ ZNF333_genic_H3K9me3_R –تكتجتاتججتكجكاجاتجتجت 5 ‘-3’ HOXA9-10_F –أكتجاجتاتجاجكاجتجتكجت 5 ‘-3’ HOXA9-10_R –جكاجكايكاجاكتجتكجتج 5 ‘-3’ GAPDH_genic_H3K36me3_F –أجكاكتاجاتجتجتج 5 ‘-3’ GAPDH_genic_H3K36me3_R –تجاتتتجاججاتكتكج 5 ‘-3’ و جابده –تاكتاجكجتتتاكججكج 5 ‘-3’ جابده-R –تكجاكاجاجاجكاجاجاجكجا 5 ‘-3’ تعديل هيستون الهدف الإيجابي الهدف السلبي H3K4me3 جابده HOXA9-10 H3K4me1 GAPDH_genic ZNF333 H3K27me3 HOXA9-10 ZNF333 H3K27ac جابده ZNF333 H3K9me3 ZNF333 HOXA9-10 H3K36me3 GAPDH_genic ZNF333 تكميلية الجدول 3: قائمة كبسولة تفجير لعلامات هيستون استخداماً (H3K4me3، H3K4me1، H3K27me3، H3K27ac، H3K9me3 و H3K36me3). تكميلية ملف 1: ورقة عمل seq ندتشيب. اضغط هنا لتحميل هذا الملف. “ملفات التعليمات البرمجية الإضافية”: qcQpcr_v1.2- R حزمة البرامج الإحصائية لتحليل تخصيب qPCR منخفضة الإدخال الأصلي seq رقاقة المكتبات. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
نظراً لطبيعة اندماجي وتعديل الكروماتين ونوكليوسومي لتحديد المواقع في تنظيم النسخي، أسلوب يتيح لقياسات متزامنة من هذه الميزات من المرجح أن توفر رؤى جديدة في التنظيم جينية. البروتوكول seq ندتشيب المقدمة هنا بروتوكول seq رقاقة أصلي الأمثل لتمكين الاستجواب المتزامنة وتعديل هيستون وكثافة نوكليوسومي في الخلايا الأولية نادرة9،10. يستخدم seq ندتشيب الهضم الأنزيمي من الكروماتين، عندما يقترن إلى إقران نهاية تسلسل موازية على نطاق واسع ونموذج توزيع خليط ضبابي، يسمح للتعديلات هيستون التحقيق على المستوى نوكليوسومي واحد deconvolution ملامح ابيجينوميك بدافع عدم التجانس داخل مجموعة من سكان. باستخدام هذا البروتوكول، أبلغنا قبل توزيع أحجام يفتت عجلت المناعية، يحدد نهاية إقران قراءة الحدود، المرتبطة بالدول الكروماتين محددة يحددها تشرومهمم10،24بصورة فريدة من نوعها.
نوعية مكتبة seq ندتشيب يعتمد على عدة عوامل، مثل جسم خصوصية وحساسية ومناسي الهضم الظروف المثلى، ونوعية الكروماتين. الخصوصية للأجسام المضادة التي تستخدم أمر حاسم في إنتاج مكتبة seq ندتشيب ناجحة. جسم مثالي يظهر تقارب عالية ضد حانمه الاهتمام مع تفاعلية عبر قليلاً مع أخرى [ابيتوبس]. من المهم أيضا اختيار حبات مغناطيسية مع تقارب أعلى للأجسام المضادة لخيار.
مناسى الهضم رد فعل الحرجة والحساسة الوقت والتركيز في هذا البروتوكول. ولذلك، عند معالجة عينات متعددة، من المهم أن كل فعل هو المحتضنة لمبلغ معادل من الوقت (راجع الخطوة 2، 2). نوعية الكروماتين هو عامل آخر آثار إلى حد كبير نتيجة ما يليها ندتشيب Fragmented الكروماتين يؤدي إلى تشكيل جانبي دون المستوى أمثل لهضم منسى والنتائج في المكتبات مع إشارة منخفضة بنسبة الضوضاء. خلية صلاحية العينات الأولية مع منخفضة أو المتدهورة الكروماتين، مثل الفورمالين–الثابتة الأنسجة (FFPE) جزءا لا يتجزأ من البارافين لا ينصح لهذا البروتوكول.
إضافة الموافقة المسبقة عن علم أثناء استخراج الكروماتين يقلل غير مرغوب فيها (أي، عشوائي) الكروماتين التجزؤ ويحافظ على سلامة من ذيول هيستون. على هذا النحو، يحتاج إلى الموافقة المسبقة عن علم لإضافتها إلى المخزن المؤقت لتحلل والمخزن المؤقت إيمونوبريسيبيتيشن السابقة فقط لاستخدام. أثناء تحديد الخلايا عن طريق التدفق الخلوي، حدد خلايا قابلة للحياة وضمان يتم فرز الخلايا بمعدل تدفق منخفض لزيادة دقة تقدير عدد الخلايا وقدرتها على البقاء للخلايا. تجنب فرز الخلايا مباشرة إلى المخزن المؤقت لتحلل. المخزن المؤقت غمد سيخفف المخزن المؤقت تحلل ويمنع permeabilization فعالة من غشاء الخلية إلى منسى. اعتماداً على نوع من الخلايا أو الكائن الحي، قد يلزم المعايرة لمنسى للحصول على الهضم الأمثل.
يتطلب seq ندتشيب في خلايا الثدييات عمق تسلسل الحد أدنى من 50 مليون إقران-يقرأ (شظايا 25 مليون) لعلامات الضيق و 100 مليون إقران-القراءات (50 مليون الشظايا) علامات عريضة والمدخلات. خوارزمية توزيع خليط ضبابي لن تؤدي على النحو الأمثل في المكتبات التي قد تم تعيين تسلسل على عمق كبير تحت هذه التوصية. سيتم تصنيف seq ندتشيب لا المروجين مع القليل من الفصل بين قيمة التوزيع المرجح لأطوال جزء مونو ودي نوكليوسومي إلى مروجي مونو-أو دي-نوكليوسومي التي تهيمن عليها. ولذلك، يجب إزالة هذه المروجين في التحليل اللاحق. يمكن أن تتولد replicates البيولوجية لزيادة الثقة في التوزيعات المتوقعة وتحديد التغير التقني في بناء مكتبة والهضم منسى.
خلافا للتكرارات السابقة الأصلية seq رقاقة البروتوكولات، seq ندتشيب يوفر وسيلة للتحقيق في تأثير اندماجي لتعديل هيكل وهيستون الكروماتين باستخدام جزء حجم وظيفة إيمونوبريسيبيتيشن لدمج nucleosome الكثافة، تحدد إمكانية مناسى، مع هستون تعديل القياسات. سيتم تطبيق seq ندتشيب الابتدائية الخلايا والأنسجة ثاقبة رواية الطبيعة التكاملية للتنظيم جينية وتسمح بتحديد هوية جينية التوقيعات بسبب عدم التجانس بين السكان.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد أ. ل. “منحة الدراسات العليا الكندية” من “المعاهد الكندية للبحوث الصحية”. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من كولومبيا البريطانية الجينوم والكندي معاهد للبحوث الصحية (استوفوا-120589) كجزء من التخلق الكندي، والبيئة ومبادرة اتحاد البحوث الصحية وقبل “البرنامج معهد البحوث تيري فوكس” منح المشروع #TFF-122869 M.H. ومعهد أبحاث تيري فوكس محقق جائزة جديدة (منحة # 1039) إلى محمد
Materials
| 1M Tris-HCl –pH 7.5 | Thermo Scientific | 15567-027 | |
| 1M Tris-HCl –pH 8 | Thermo Scientific | 15568-025 | |
| 0.5M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 5M NaCl | Sigma | 1001385276 | |
| Triton X-100 | Sigma | 1001412354 | |
| Sodium-Deoxycholate | Sigma | 1001437582 | |
| SDS | Thermo Scientific | 15525-017 | |
| Sodium-Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| 100% EtOH | NA | NA | |
| V-bottom 96 well plate (AB 1400) | Thermo Scientific | AB-1400-L | |
| Gilson P2 pipetman | Mandel | F144801 | |
| Gilson P10 pipetman | Mandel | F144802 | |
| Gilson P20 pipetman | Mandel | F123600 | |
| Gilson P100 pipetman | Mandel | F123615 | |
| Gilson P200 pipetman | Mandel | F123601 | |
| Gilson P1000 pipetman | Mandel | F123603 | |
| Micrococcal Nuclease | NEB | M0247S | |
| Thermo Mixer C (Heating block mixer) | Eppendorf | 5382000023 | |
| Multi 12-channel Pippet P20 | Rainin | 17013803 | |
| Multi 12-channel Pippet P200 | Rainin | 17013805 | |
| 1.5 ml LoBind tube | Eppendorf | 22431021 | |
| 0.5 ml LoBind tube | Eppendorf | 22431005 | |
| Plastic Plate Cover | Edge Bio | 48461 | |
| PCR cover | Bio Rad | MSD-1001 | |
| Aluminum Plate Cover | Bio Rad | MSF-1001 | |
| Elution buffer (EB buffer) | Qiagen | 19086 | |
| 1M DTT | Sigma | 646563 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Eppendorf | 22625004 | |
| Ultrapure water | Thermo Scientific | 10977-015 | |
| Protein G dynabeads | Thermo Scientific | 10001D | |
| Protein A dynabeads | Thermo Scientific | 10001D | |
| Protease inhibitor Cocktail | Calbiochem | 539134 | |
| Rotating platform | Mandel | 1b109-12052010 | |
| Plate magnet | Alpaqua | 2523 | |
| Domed 12-cap strip | Bio Rad | TCS1201 | |
| Buffer G2 | Qiagen | 1014636 | |
| Protease | Qiagen | 19155 | |
| Tube Magnet (DynaMag-2) | Thermo Scientific | 12321D | |
| Tube Magnet (DynaMag-2) | LabCore | 730-006 | |
| V shape Plastic reservoir | Mandel | S0100A | |
| Vortex | Mandel | C1801 | |
| Mini Fuge | Mettler Toledo | XS2035 | |
| Analytical scale | Mandel | LB109-12052010 | |
| Quick Ligation Reaction Buffer, 5X | NEB | B6058S | |
| DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | M0210S | |
| Klenow Fragment (3'-5' exo) | NEB | M0212S | |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Deoxynucleotide Solution mix, 10mM | NEB | N0447S | |
| dATP Solution 10mM | NEB | N0440S | |
| Quick T4 DNA Ligase | NEB | M0202T | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP), 25mM | NEB | P0756S | |
| DNA Polymerase | Thermo Scientific | F549L | |
| NEBuffer 2 | NEB | B7002S | |
| Hank's buffered salt solution | Thermo Scientific | 14025076 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | A3160702 | |
| phosphate buffer saline | Thermo Scientific | 10010023 | |
| H3K4me3 | Cell Signaling | 9751S | |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410037 | |
| H3K27me3 | Diagenode | pAb-069-050 | |
| H3K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| H3K9me3 | Diagenode | C15410056 | |
| SeraMag super-paramagnetic beads |
References
- Simpson, R. T. Nucleosome Positioning: Occurrence, Mechanisms, and Functional Consequences. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 40, 143-184 (1991).
- Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundmamental particle of the eukaryotic chromosome. Cell. 98, 285-294 (1999).
- Schones, D. E., et al. Dynamic regulation of nucleosome positioning in the human genome. Cell. 132 (5), 887-898 (2008).
- Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).
- Shiio, Y., Eisenman, R. N. Histone sumoylation is associated with transcriptional repression. PNAS. 100 (23), 13225-13230 (2003).
- Li, L., Lorzadeh, A., Hirst, M. Regulatory variation: An emerging vantage point for cancer biology. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 6 (1), 37-59 (2014).
- Jiang, J., et al. Investigation of the acetylation mechanism by GCN5 histone acetyltransferase. PLoS ONE. 7 (5), (2012).
- Kouzarides, T. Histone methylation in transcriptional control. Curr. Opin. Genet. Dev. 12 (2), 198-209 (2002).
- Brind’Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat. Commun. 6, 6033 (2015).
- Lorzadeh, A., et al. Nucleosome Density ChIP-Seq Identifies Distinct Chromatin Modification Signatures Associated with MNase Accessibility. Cell Rep. 17 (8), 2112-2124 (2016).
- Noll, M., Kornberg, R. D. Action of micrococcal nuclease on chromatin and the location of histone H1. J. Mol. Biol. 109 (3), 393-404 (1977).
- Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome wide protein binding. eLife. 4, 09225 (2015).
- Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. -. P., Widom, J. A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution. Nature. , (2012).
- Cui, K., Zhao, K. Genome-wide approaches to determining nucleosome occupancy in metazoans using MNase-Seq. Methods Mol. Biol. 833, 413-419 (2012).
- Mieczkowski, J., et al. MNase titration reveals differences between nucleosome occupancy and chromatin accessibility. Nat. Commun. 7, 11485 (2016).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). JOVE. (41), (2010).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
- Zheng, Y., Josefowicz, S. Z., Kas, A., Chu, T. T., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Genome-wide analysis of Foxp3 target genes in developing and mature regulatory T cells. Nature. 445 (7130), 936-940 (2007).
- Krishnakumar, R., Gamble, M. J., Frizzell, K. M., Berrocal, J. G., Kininis, M., Kraus, W. L. Reciprocal Binding of PARP-1 and Histone H1 at Promoters Specifies Transcriptional Outcomes. Science. 319 (5864), 819-821 (2008).
- Mendenhall, E. M., et al. Locus-specific editing of histone modifications at endogenous enhancers. Nat. Biotechnol. 31 (12), 1133-1136 (2013).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol. Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat. Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
- Fraley, C., Raftery, A. E. MCLUST: Software for Model-Based Cluster Analysis. J. Classif. 16 (2), 297-306 (1999).
Cite This Article
Lorzadeh, A., Lopez Gutierrez, R., Jackson, L., Moksa, M., Hirst, M. Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis. J. Vis. Exp. (130), e56085, doi:10.3791/56085 (2017).