Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

Not: Bu iletişim kuralı için en küçük girişi tek IMMUNO-yağış (IP) tepki başına 10.000 hücre nedir. Sağlanan deneysel çalışma sayfasını yazdırmak ve deney planı için bir kılavuz olarak kullanmaktadır. İncubations oda sıcaklığında ~ 22 ° C’de olduğu varsayılır Bütün arabellek Tarifler Tablo 1′ de sağlanmaktadır. Tüm arabellekleri 4 ° C’de depolanan ve buz üzerinde işlem sırasında aksi belirtilmediği sürece devam etti. 1. hücre hazırlık Kültürlü hücreleri Fosfat tampon salin (PBS) 1 mL hücrelerle yıkama ve doğru bir hemasitometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek. Bir milyondan fazla hücreler varsa, PBS hacmi artırın. Steril 1,5 mL tüp ve 500 x g 4 ° C’de 6 dk için aşağı spin içine eşdeğer 70.000-100,000 hücre ve hücre saymak, aliquot dayanarak Bir pipet kullanarak, yavaş yavaş kaldırmak ve süpernatant (hücre Pelet bozmadan) atmak ve Pelet buz gibi lizis arabellek + 1 proteaz inhibitörü kokteyl (PIC) 1000 hücre konsantrasyonu x resuspend / µL. Mix de 20-30 yukarı ve aşağı pipetting tarafından kez. Hücre kümeleri kesintiye önemlidir. Baloncuklar oluşturmak deneyin. Doğrudan gün 1’e (Bölüm 2) ndChIP-seq protokolünün devam etmek ya da flaş dondurma hücre Pelet sıvı azot ve-80 ° C’de store Sıralanmış hücreleri Hank tamponlu tuz solüsyonu (HBSS), veya PBS + % 2 fetal sığır serum (FBS) 350 µL ile 1,5 mL tüp içine 70.000-100,000 sıralanmış16 hücreleri toplamak. Spin aşağı her hücre aliquot 500 x g 4 ° C’de 6 dk de Bir pipet kullanarak, yavaş yavaş süpernatant (hücre Pelet bozmadan) kaldırın ve resuspend buz gibi lizis tampon + 1 x 1.000 hücrelerin son bir konsantrasyon PIC / µL. Mix de lizis arabellekte yukarı ve aşağı pipetting tarafından 20 – 30 kez. Hücre kümeleri tahrip edilmesini sağlamak. Baloncuklar oluşturmak deneyin. Doğrudan gün 1’e (Bölüm 2) ndChIP-seq protokolünün devam etmek ya da flaş dondurma hücre Pelet sıvı azot ve-80 ° C’de store 2. gün 1: ndChIP-seq Antikor-boncuk karmaşık hazırlanması 37 ° C su banyosu ve nedense odamızda buz kovası hazırlamak. Buz üzerinde çalışma, PIC x 1 x IP tampon/1 ve 1 x antikor (Ab) seyreltme arabellek hazırlamak ve buz üzerinde tutun. (Bkz: tartışma için seçim kriterleri) Protein A (veya G) manyetik boncuklar 4 ° C Muhafazası ve mix yumuşak nabız-vortexing tarafından çok iyi almak. Buz üstünde tutun.Not: Her zaman tam bir girdap tüp içinde oluşan vortexing durdurulur nabız-vortexing anlamına gelir. 24 µL Protein A (veya G), manyetik boncuklar IP tepki başına yeni bir 2 mL tüp içine aktarın. Boncuk hacmi kaydetmek ve tüp buz üzerinde tutun. Örnek, 7 IP için kullanmak için 7 x 24 µL 168 µL =. Tüp üzerinde tüp mıknatıs yerleştirmek ve açık gösteren boncuk ayırma olmak çözüm için bekleyin. Boncuk bozmadan, dikkatle bir pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve. Kapalı tüp mıknatıs tüp alıp buzluğa yerleştirin. Buz gibi IP arabelleği eşit bir birim (Yani, boncuk ilk cilt) + 1 x PIC karışımı ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Değil girdap yapmak. IP arabellek + 1 x PIC + boncuk geri tüp mıknatıs üzerine yerleştirin ve açık gösteren boncuk ayırma olmak çözüm için bekleyin. Boncuk bozmadan, dikkatle bir pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve. Soğuk IP tampon + 1 X PIC yıkama iki kez daha 3 yıkar toplam için yineleyin. Son yıkama sonra buz gibi IP arabelleği eşit bir birim (Yani, boncuk ilk cilt) + 1 x PIC mix boncuk resuspend. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Değil girdap yapmak. Tüp buz üzerinde tutun. Buz üzerinde IP tampon + PIC 10 mL V şeklinde bir 25 mL rezervuar içine dökün. Bir çok kanallı pipet kullanarak ekleyin buz gibi IP arabelleği 130 µL + 1 x PIC karışımı temiz V-alt 96-iyi bireysel kuyu içine plaka. IP başına bir şey doldurun. Plaka olarak etiket “Ab-boncuk kompleksi”. 12 µL yıkanmış Protein A (veya G), manyetik boncuklar her de içeren IP tampon + PIC ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Kalan yıkanmış boncuk buz üzerinde tutun. Doğrulanmış antikorlar onların soğuk hava deposu ve tezcan gerekirse buz üzerinde elde edilir. Buz üzerinde çalışan, 1 x Ab seyreltme arabelleği Tablo 2′ de gösterilen konsantrasyonları ile antikor oranında seyreltin. Ab-boncuk karmaşık plaka her şey için uygun, seyreltilmiş antikor (Tablo 1) 1 µL ekleyin. Antikor anahtarı kuyuya kaydedin. Çok kanallı pipet kullanarak, her satır yukarı ve aşağı 20 kere pipetting karıştırın. İpuçları satırlar arasında değiştirin. Ab-boncuk karmaşık plaka çok iyi bir alüminyum plaka kapağı kapatın ve en az 2 h için dönen bir platform üzerinde 4 ° C’de kuluçkaya.Not: Bu kuluçka adım 2.4 başlamak için hazır kadar devam edebilirsiniz. Hücre lizis ve Kromatin sindirim Buz üzerinde çalışma, hazırlamak lizis arabellek x 1 + 1 x PIC ve 1 mL MNase ben seyreltme tampon (Tablo 3) ve buz üzerinde tutun. Hücre topakları onların-80 ° C depolama (veya taze hazırlanmış Eğer buz) alın. Her hücre Pelet bir 10 s sonra buz için transfer için 37 ° C su banyosunda çözülme. Her hücre Pelet hemen buz gibi 1 lizis tampon + 1 x PIC 10.000 hücre/20 µL ve mix 10 kez pipetting tarafından son bir konsantrasyon için yukarı ve aşağı, kabarcıklar oluşturmadan x ekleyin. Örneğin, 70.000 hücreler için son 140 µL birimdir. Buz, aliquot 20 µL/kuyu içine bir 96-şey plaka elde edilen lysates üzerinde çalışıyor. Plastik bir mühür ile plaka kapak ve 20 dk. etiket plaka “MNase sindirim” buz üzerinde kuluçkaya ve wells bir şablon anahtar için kayıt. Kromatin sindirim tepki tam bir zamanlaması sağlamak için örnekleri 2’den fazla satır içeren bir zaman sindirim için devam etmeyin. Sadece 20 dk lizis tamamlanmadan önce MNase seyreltik ben enzim MNase ile ben seyreltme, tampon 20 U/µL, son bir konsantrasyon ve buz üzerinde tutun. Buz üzerinde çalışma, MNase hazırlamak ben sindirim master mix Tablo 4 ve aliquot 20 µL Mix örnekleri artı 5 µL ölü cilt her satır başına göre 96-şey rezervuar plaka bir satır ve buz üzerinde tutun. İki satır için birim olmalıdır: (20 µL x 2) + 5 µL 45 µL =. Kuluçka lysates bitirdikten sonra MNase sindirim plaka buz kaldırın. Bir çok kanallı pipet kullanarak ekleyin MNase 20 µL ben sindirim master karışımı örnekleri her satır içine ve mix 10 kat yukarı ve aşağı pipetting. İpuçları satırlar arasında değiştirin. Tam olarak 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya. 5 dk sonra reaksiyon durdurmak, örnekleri her satır 250 µM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 6 µL eklemek için bir çok kanallı pipet kullanın ve yukarı ve aşağı mix bir kaç kez. İpuçları satırlar arasında değiştirin. EDTA eklenmesinden sonra pipet ayarı 20 µL ve mix 10 kat yukarı ve aşağı sindirim tepki tam durdurmak sağlamak için pipetting tarafından geçin. İpuçları satırlar arasında değiştirin. Bir çok kanallı pipet kullanarak sindirilmiş MNase örnekleri, her satır için de aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından 6 µL 10 x lizis arabellek ve karışımı ekleyin. Bir plastik mühür ile kapak ve 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya. Giriş ayrılık ve Ön Temizleme Buz, aynı Pelet/şablon steril, tek bir hücre için tüm wells buz, 1,5 mL tüp (şablon kimliği ile önceden etiketli) ve karışımı önceden soğutulmuş havuzu üzerinde 15 dk kuluçka iyice takip ama yavaş yavaş deterjan köpük önlemek için bir pipet kullanarak. Her hücre Pelet/şablonu için yeni bir içine sindirilmiş Kromatin steril, 0.5 mL tüp (şablon kimliği ile önceden etiketli) ve mağaza 4 ° C’de 8 µL gecede aktarın. Bu giriş denetimi olarak görev yapacak. 48 µL aliquots, sindirilmiş Kromatin kalan hacmi yeni bir 96-şey plaka dağıtın. Hücre Pelet/Şablon 1 kuyu A01-A06 gider, hücre Pelet/Şablon 2 kuyu A07-A12, vbgider. Wells bir şablon anahtar için kayıt. Plaka “Öncesi takas” etiket. Bir çok kanallı pipet kullanarak, IP arabellek x 1 + 1 PIC x 120 µL ve yıkanmış Protein A (veya G) manyetik boncuklar 12 µL 2.3.3 adımından öncesi takas plaka her kuyunun içine ekleyin. Her satır aşağı yukarı 10 kez pipetting karıştırın. İpuçları satırlar arasında değiştirin. Plaka, çok iyi bir alüminyum plaka kapağı kapatın ve en az 2 h 4 ° C’de dönen bir platform üzerinde kuluçkaya. Immunoprecipitation tepki Bu adımı başlamadan önce 10 için centrifuging tarafından her iki tabak en az 2 h. hızlı spin için Ab-boncuk karmaşık plaka (Adım 2.1.10) ve öncesi takas plaka (Adım 2.3.4) inkübe emin olun 200 x g s. Ab-boncuk karmaşık plaka (Adım 2.1.10) bir tabak mıknatıs yerleştirmek ve bekleyin 15 s netlik eriyik. Dikkatle kaldırmak ve boncuk bozmadan bir pipet kullanarak süpernatant. Plaka plaka mıknatıs kaldırın ve buz üzerinde tutun. Ön Temizleme tepki plaka (Kimden adım 2.3.4) bir tabak mıknatıs yerleştirmek ve bekleyin 15 s ayırmak boncuk ve çözüm açık hale gelir. Boncuk bozmadan, dikkatli bir şekilde karşılık gelen kuyu karmaşık plaka buz ve karışımı yavaşça 15 kez yukarı ve aşağı pipetting tarafından tutulan Ab-boncuk yapımı için bir pipet kullanarak süpernatant aktarın. İyi bir alüminyum ile plaka kapak plaka ve kuluçkaya mühür (12-18 h) dönen bir platform üzerinde 4 ° C’de gecede. Plaka “IP reaksiyonu” yeniden etiketleyin. 3. gün 2: ndCHIP-seq Yıkama ve elüsyon Isıtma Mikser 65 ° C’ye ayarla Buzda, düşük tuz yıkama tampon ve yüksek tuz yıkama tampon hazırlayın. Hızlı spin IP tepki plaka için 10 adım 2.4.3 200 x g s. IP tepki plaka üzerinde bir plaka mıknatıs yerleştirmek ve bekleyin 15 s netlik eriyik. Bir çok kanallı pipet boncuk bozmadan kullanarak, dikkatle kaldırmak ve süpernatant. Plaka mıknatıs Tabağını alıp buza yerleştirin. IP tepki plaka örneklerinde her satır için buz gibi düşük tuz, 150 µL yıkama arabellek ve karışımı yavaş yavaş 10 kat yukarı ve aşağı tamamen resuspend boncuk için ekleyin. IP tepki plaka plaka mıknatıs geri üzerine yerleştirin, boncuk ayırmak bekleyin ve çok kanallı pipet kullanarak, boncuk bozmadan kaldırmak ve süpernatant atın. Plaka geri Buza koyun ve 3.1.3 ve 3.1.4 toplamda 2 yıkama arasındaki adımları yineleyin. Buza, yüksek tuz 150 µL yıkama arabellek ve karışımı yavaşça 10 kat yukarı ve aşağı tamamen boncuk resuspend için pipetting tarafından IP tepki plaka örneklerinde her satırı ekleyin. IP tepki plaka plaka mıknatıs geri üzerine yerleştirin, boncuk ayırmak bekleyin ve çok kanallı pipet kullanarak, boncuk bozmadan kaldırmak ve süpernatant atın. IP tepki plaka Buza koyun ve yanında yeni bir 96-şey plaka önceden chill. IP tepki plaka örneklerinde her satır için yüksek tuz 150 µL yıkama arabellek ve karışımı yavaşça 10 kat yukarı ve aşağı tamamen boncuk resuspend için pipetting tarafından ekleyin. Resuspension sonra her satırı örnekleri yeni, önceden soğutulmuş, 96-da plaka karşılık gelen satırı aktarın. Plaka “IP reaksiyonu” etiket. Eski plaka atmak. Yeni IP tepki plaka plaka mıknatıs yerleştirmek ve ayırmak boncuk için bekleyin. Bir çok kanallı pipet boncuk bozmadan kullanarak, dikkatle kaldırmak ve süpernatant. Plaka oda sıcaklığında tutmak. Her satıra IP tepki plaka örneklerinin 30 µL çip elüsyon arabelleği (EB) ve yavaş yavaş yukarı ve aşağı pipetting tarafından 10 kez karıştırın. Kabarcık oluşumunu önlemek emin olun. PCR kapak ile de plaka mühür ve bir Isıtma karıştırıcı 65 ° c karıştırma 1.350 rpm hızına sahip 1,5 saat için kuluçkaya. IP tepki plaka 200 x g 4 ° C’de 1 dk. için de aşağı 1,5 saat kuluçka sonra spin Isıtma Mikser ile 50 ° c ayarını değiştirin Spin sonra IP tepki plaka üzerinde bir plaka mıknatıs yerleştirmek ve temizlemek çözüm için bekleyin. Bir çok kanallı pipet kullanarak, boncuklar, bozmadan dikkatle 30 µL süpernatant ile yeni bir 96-şey plaka aktarın. Taze ipuçları her satır için kullanın. Plaka “IP reaksiyonu” etiket ve oda sıcaklığında saklayın. Protein sindirimi % 30 PEG/1 M NaCl manyetik boncuk17 (arabellek kompozisyon tablo) Çözüm 4 ° C buzdolabından almak ve en az 30 dk kritik için oda sıcaklığında saklayın: boncuk çözüm tam olarak devam etmeden önce oda sıcaklığına ulaştığından emin olmak. Giriş denetimi örnekleri 4 ° C depolama (Adım 2.3.2) ve hızlı spin almak. Bir pipet kullanarak birim ölçü ve önceden seçilen giriş wells (boş wells) için giriş kontrol örnekleri son hacmi 30 µL. Transfer için ultrasaf su IP tepki plaka (Adım 3.1.12) her giriş denetimine ekleyin. İyi örnek anahtar için kayıt. Buzda, Tablo 5 ve aliquot eşit hacim 96-şey rezervuar plaka bir satır gösterildiği gibi Protein sindirimi Master Mix hazırlayın. Bir çok kanallı pipet kullanarak, IP tepki plaka örneklerinde her satır için 40 µL Protein sindirimi Master mix ve yavaş yavaş 10 kat yukarı ve aşağı karıştırın. PCR kapak ile de plaka mühür, 200 x g 1 dk. için de aşağı spin ve bir Isıtma karıştırıcı 50 ° C’de 30 min 650 rpm ayarlamak için kuluçkaya. Plaka kuluçka iken, taze % 70 etanol (alkol) hazırlamak ve oda sıcaklığında saklayın. 30 dk kuluçka tamamlandıktan sonra IP tepki plaka 200 x g 1 dakika, 4 ° c de spin Plaka oda sıcaklığında tutmak.Not: Toplam hacim şimdi ~ 70 µL/iyi olması gerekir. Boncuk temizlik % 30 PEG/1 M NaCl manyetik boncuk solution’ı kullanma PEG/1 M NaCl manyetik oda sıcaklığında boncuk çözüm temiz 96-şey rezervuar plaka bir satır aliquot (örnek başına 75 µL # satır x). Bir çok kanallı pipet kullanarak oda sıcaklığında çalışma 70 µL (1:1 oran) % 30 PEG/1 M NaCl manyetik boncuk çözüm örnekleri IP tepki plaka her satırı için ve 10 kat yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. İpuçları satırlar arasında değiştirin. Plaka 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Plaka plaka mıknatıs yerleştirmek ve boncuk ayırmak izin vermek 5 min için kuluçkaya. Bir pipet boncuk bozmadan kullanarak, dikkatle kaldırmak ve süpernatant. Boncuk tutun. IP tepki plaka hala plaka mıknatıs üzerinde olmakla birlikte, oda sıcaklığında 150 µL eklemek örnekleri, her satır için bir çok kanallı pipet kullanarak alkol ve 30 için kuluçkaya s. Sonra 30 s, bir çok kanallı pipet kullanarak kaldırmak ve süpernatant atın. Bu bir kez daha 2 yıkama toplam için tekrarlayın. 3 dk. görsel olarak incelemek için tüm alkol buharlaşıp emin olmak için plaka ikinci alkol yıkama sonra ‘kuru’ plaka plaka mıknatıs üzerinde kuluçkaya. Eğer değilse, 1 dk. daha düşük verim boncuk sonuçlarında aşırı kurutma plaka kuluçkaya. Plaka mıknatıs ve çok kanallı pipet kullanarak kapalı plaka almak 35 µL EB (Tablo reçetesi) ekleyin. De aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından karıştırın. İpuçları satırlar arasında değiştirin. Elute için 3 dakika için oda sıcaklığında kuluçkaya. Kuluçka sonra IP tepki plaka plaka mıknatıs geri üzerine yerleştirin ve 2 min için kuluçkaya. Boncuk ayrı olmalıdır ve çözüm açık olacak. Bir çok kanallı pipet kullanarak, boncuklar, rahatsız etmeden dikkatle süpernatant yeni bir 96-şey plaka karşılık gelen kuyu aktarın. Bir alüminyum plaka kapak ile plaka mühür, “IPED + giriş DNA” etiket ve stok gecede 4 ° C’de veya -20 ° c için uzun süreli (> 48 h) depolama. 4. gün 3: Kütüphane İnşaat Son onarım ve fosforilasyon Son onarım/fosforilasyon reaksiyon için girişi IPED nedir + giriş plaka adım 3.3.10. Çözdürme sonra spin 200 x g 4 ° C’de 1 dk. için de aşağı plaka ve buz üzerinde tutun. Tüm reaktifler (enzimler) hariç son onarım/fosforilasyon reaksiyonu (Tablo 6) için gerekli ve oda sıcaklığında erimek, sonra hemen buz transfer-20 ° C dondurucudan almak. Buz üzerinde çalışma, steril, 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde son onarım/fosforilasyon Master Mix ayarlamak için Tablo 6 izleyin. Enzim olmayan bileşenlerin yanı sıra sonra de darbe-vortexing tarafından mix ve tüp geri Buza koyun. İlgili enzimler soğutulmuş tüp serin rafa tezgah için onların soğuk depolama ve taşıma almak. Her enzim tarafından flicking tüp, hızlı spin karıştırın ve geri soğutulmuş tüp serin rafa yerleştirin. Enzim pipetting zaman, yavaş yavaş bir doğru ses aktarımı sağlamak için Aspire edin. Eklenmesinden sonra ucu yukarı ve aşağı pipetting tarafından ana karışımda yıkayın. Bir kez enzimler eklenir, yavaşça buza geri darbe-master mix 5 kere sonra hızlı spin tüm bileşenleri eşit dağılımı temin ve hemen tüp yerleştirmek için girdap. Buzda aliquot son onarım/fosforilasyon Master Mix yeni bir 96-şey rezervuar plaka bir satır içine uygun bir hacmi; bölünmemeli olabilmesi için: (15 µL # satır x) + 5 µL ölü cilt. İki satır için bir örnek hesaplama: (15 µL x 2) + 5 µL 35 µL/iyi =. Bir çok kanallı pipet kullanarak, son onarım/fosforilasyon Master Mix 15 µL örnekleri her satırı için ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından 10 kez karıştırın. İpuçları satırlar arasında değiştirin. Plastik bir kapak ile plaka mühür, 200 x g 4 ° C’de 1 dk. için de aşağı spin ve 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya. Boncuk temizlik sonra son onarım ve fosforilasyon 4 ° C buzdolabı, % 20 PEG/1 M NaCl manyetik boncuk çözüm ve % 30 PEG/1 M NaCl çözüm almak ve en az 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.Not: % 30 PEG/1 M NaCl çözüm DOES değil manyetik boncuklar içerir. Her iki çözüm de oda sıcaklığına ulaştıktan sonra her örnek için 80 µL PEG/1 M NaCl ve % 20 PEG/1 M NaCl manyetik boncuk çözümleri 1:2 karışımı hazırlayın. 24 örnekleri için bir örnek: 24 = 1,920 x 80 µL µL (640 µL % 30 PEG/1 M NaCl ve % 20 PEG/1 M NaCl manyetik boncuk çözümleri 1.288 µL). Aliquot boncuk çözüm mix, eşit hacim, 96-şey rezervuar plaka bir satır ve oda sıcaklığında saklayın. Aliquot EB arabellek (örnek başına 40 µL # satır x) bir temiz 96-şey rezervuar plaka bir satır içine. İki satır için bir örnek: x 2 = 80 40 µL µL/iyi. Bir çok kanallı pipet kullanarak, hazırlanan boncuk Mix 75 µL 4.2.2 örnekleri her satır adım adım 4.1.7 ve yukarı ve aşağı 10 kat karışımı ekleyin. İpuçları satırlar arasında değiştirin. 15 dk. devam boncuk temizlik yordamı ile oda sıcaklığında adımları 3.3.3-3.3.10 içinde özetlenen kuluçkaya. Bir plastik mühür, hızlı spin ile plaka kapak ve Buza koyun. 4.3 adıma geçin. A-takip tepki A-takip reaksiyonu (Tablo 7) için gerekli tüm reaktifler (enzimler) hariç-20 ° C-dondurucu almak, onları oda sıcaklığında çözülmeye sonra hemen buz aktarmak. Buz üzerinde çalışma, A-takip Master Mix steril, 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde ayarlamak için Tablo 7 izleyin. Adımları 4.1.4-4.1.6 belirtildiği gibi genel enzimatik demlemek kurulum yönergelerini uygulayın. Bir çok kanallı pipet kullanarak, A-takip Master Mix 15 µL örnekleri her satırı için ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından 10 kez karıştırın. İpuçları satırlar arasında değiştirin. PCR kapak ile plaka mühür, 200 x g 4 ° C’de 1 dk. için de aşağı spin ve bir thermocycler 30 dk 37 ° C’de kuluçkaya. Kuluçka sonra spin 200 x g 1 dk. için de aşağı plaka ve oda sıcaklığında saklayın. Boncuk Temizlik-up A-takip sonra 4.2. adımda açıklanan adımları uygulayın. Etiket “A-kuyruk + BC”, hızlı spin, plastik bir mühür ile plaka kapak ve Buza koyun. 4.5 adıma geçin. Adaptör ligasyonu Bağdaştırıcı ligasyonu reaksiyon (Tablo 8) için gerekli tüm reaktifler (enzimler) hariç-20 ° C-dondurucu almak, onları oda sıcaklığında çözülmeye sonra hemen buz aktarmak. 10 µM PE bağdaştırıcısı (ek tablo 1) hisse senedi çözüm almak ve seyreltik 0,5 µM EB kullanarak. İyi darbe vortexing tarafından karıştırın. Gerekli 3 µL birimdir örnekleri sayısı x. Buzda aliquot 0.5 µM PE adaptörü, eşit hacim, bir temiz 96-şey rezervuar tabak 12 kuyu çalışma. Buz üstünde tutun. Buz üzerinde çalışma, bağdaştırıcı ligasyonu Master Mix steril, 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde ayarlamak için Tablo 8 izleyin. Adımları 4.1.4-4.1.6 belirtildiği gibi genel enzimatik demlemek kurulum yönergelerini uygulayın. 5 X hızlı tüp ligasyonu arabellek tam olarak çözülmüş ve kullanmadan önce çok iyi karışık olduğundan emin olun. Buzda aliquot bağdaştırıcısı ligasyonu Master Mix yeni bir 96-şey rezervuar plaka bir satır içine uygun bir hacmi. Örneğin, iki satırları hesaplaması: (23 µL x 2) + 5 µL 51 µL/iyi =. Plaka buz üzerinde tutun. Bir çok kanallı pipet kullanarak ekleyin 0.5 µM 2 µL adım 4.4.1 ve mix örnekleri her satır sonu (PE) eşleştirilmiş bağdaştırıcısına. İpuçları satırlar arasında değiştirin. Bir çok kanallı pipet kullanarak, bağdaştırıcı ligasyonu Master Mix 23 µL örnekleri her satırı için ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından 15 kere karıştırın. İpuçları satırlar arasında değiştirin. Metal bir kapak, etiket “Ligasyonu”, 200 x g 4 ° C’de 1 dk. için aşağı spin ile plaka mühür ve oda sıcaklığında gecede kuluçkaya. 4. gün: Boncuk temizlik #1 sonra bağdaştırıcı ligasyonu 4 ° C buzdolabı, % 20 PEG/1 M NaCl manyetik boncuk çözüm almak ve en az 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Çözüm sıcaklığına süre taze hazırlamak alkol. Aliquot % 20 PEG/1 M NaCl manyetik boncuk çözüm, örnek, bir satır bir 96-şey rezervuar içine başına 55 µL plaka ve oda sıcaklığında saklayın. İki satır için bir örnek: 2 = 110 x 55 µL µL/iyi. Aliquot EB arabellek, örnek, bir satır bir temiz 96-şey rezervuar plaka içine başına 50 µL. İki satır için bir örnek: 2 = 100 x 50 µL µL/iyi. Bir çok kanallı pipet kullanarak, 48 µL % 20 PEG/1 M NaCl manyetik boncuk çözüm ligasyonu plaka örneklerinde her satır içine adım 4.5.6 ve aşağı yukarı 10 kez karıştırın. İpuçları satırlar arasında değiştirin. 15 dk. devam boncuk temizlik yordamı ile oda sıcaklığında adımları 3.3.3-3.3.7 içinde özetlenen kuluçkaya. Plaka mıknatıs ve çok kanallı pipet kullanarak kapalı plaka almak 45 µL EB (Tablo reçetesi) ekleyin. De aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından karıştırın. İpuçları satırlar arasında değiştirin. Elute için 3 dakika için oda sıcaklığında için kuluçkaya. Kuluçka sonra IP tepki plaka plaka mıknatıs geri üzerine yerleştirin ve bir çok kanallı pipet boncuk bozmadan kullanarak 2 dakika süreyle kuluçkaya, dikkatle süpernatant yeni bir 96-şey plaka karşılık gelen kuyu transfer. Plaka etiket “Ligasyonu + 1 M.Ö.”. Her şey için 10 x PCR yüksek sadakat arabelleği 5 µL ve de yukarı ve aşağı pipetting karıştırın. İpuçları satırlar arasında değiştirin. Bir plastik mühür, hızlı spin ile plaka kapak ve oda sıcaklığında saklayın. Boncuk temizlik #2 bağdaştırıcısı ligasyonu sonra Boncuk temizlik bölümünde 4,6 aşağıdaki değişikliklerle açıklandığı gibi gerçekleştirmek: 60 µL % 20 PEG/1 M NaCl manyetik boncuk çözüm ligasyonu + M.Ö. 1 plaka (Adım 4.6.7) etkin her kuyuya ekleyin ve EB arabelleği 35 µL kullanarak boncuk elute. Plaka etiket “Ligasyonu + M.Ö. 2” ve buz üzerinde tutun. PCR güçlendirme -20 ° C dondurucudan PCR reaksiyon (Tablo 9) için gerekli reaktifler (enzimler dışında) almak, onları oda sıcaklığında çözülmeye sonra hemen buza koy. Buz üzerinde çalışma, steril, 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde PCR Master Mix ayarlamak için Tablo 9 izleyin. Genel demlemek kurulum adımları 4.1.4-4.1.5 içinde özetlenen yönergelere bakın. Buzda aliquot PCR Master Mix yeni bir 96-şey rezervuar plaka bir satır içine uygun bir hacmi. Buz üstünde tutun. Örnek hesaplamalar için 4.5.4 adıma bakın. Buz üzerinde bir çok kanallı pipet kullanarak çalışma her benzersiz 12.5 µM PCR dizin oluşturma astar (ek tablo 2) tüp ligasyonu her kuyuya + M.Ö. 2 plaka (Adım 4.7.1) ters 2 µL ve yukarı ve aşağı yavaş yavaş karıştırın. İpuçları satırlar arasında değiştirin. Plaka buz üzerinde tutun. Buz üzerinde çalışan bir çok kanallı pipet kullanarak ekleyin 23 µL PCR ana karışımı örnekleri her satır içine adım 4.8.3 ve mix 10 kat yukarı ve aşağı pipetting. PCR kapak ile plaka mühür, 200 x g 1 dk. için de aşağı spin ve bir thermocycler kuluçkaya (PCR bisiklet koşullarını için bkz: Tablo 10 ). Boncuk temizlik PCR güçlendirme sonra PCR güçlendirme sonra plaka 200 x g 1 dakika, 4 ° c de spin Boncuk temizlik bölümünde 4,6 aşağıdaki değişikliklerle açıklandığı gibi gerçekleştirmek: 51 µL % 20 PEG/1 M NaCl manyetik boncuk çözüm her PCR reaksiyon ekleyin ve EB arabelleği 25 µL kullanarak boncuk elute. Bir alüminyum kapaklı plaka mühür ve örnekleri-20 ° C’de 1 dk. deposu için spin de 200 x g aşağı Oluşturulmuş kitaplıklar doğrulamak için DNA miktar Floresans tabanlı tahlil kullanarak gerçekleştirmek, bir çip tabanlı Kapiler Elektroforez Analyzer’ı (yüksek hassasiyet tahlil) nihai ürün görselleştirmek ve zenginleştirme çalıştırmak kantitatif PCR (qPCR) (bkz: Temsilcisi Results, ndChIP-seq Kütüphane kalite qPCR tarafından doğrulama).