Toxicidad del amiloide β42 de modelado y la neurodegeneración en cerebro de pez cebra adulto
Summary
Este protocolo describe la síntesis, caracterización y la inyección de péptidos monomérico amiloide-β42 para generar toxicidad amiloide en pez cebra adulto para establecer un modelo de la enfermedad de Alzheimer, seguido por análisis histológicos y la detección de agregaciones.
Abstract
Enfermedad de Alzheimer (EA) es una debilitante enfermedad neurodegenerativa en la que la acumulación de amiloide tóxico-β42 (Aβ42) péptidos conduce a degeneración sináptica, inflamación, muerte neuronal y déficit de aprendizaje. Los seres humanos no pueden regenerar las neuronas perdidas en el caso de AD en parte debido a la deteriorada capacidad proliferativa de las células progenitoras neuronales (NSPCs) y reducción de la neurogénesis. Por lo tanto, terapias regenerativas eficaces también deben aumentar la proliferación y capacidad neurogénica NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) es un organismo regenerativo y podemos aprender los programas moleculares básicos que podríamos diseñar enfoques terapéuticos para hacer frente a AD. Por esta razón, fue necesaria la generación de un modelo de AD-como en el pez cebra. Con nuestra metodología, podemos introducir derivados sintéticos de Aβ42 péptido con capacidad penetrante de tejido en el cerebro del pez cebra adulto y analizar la patología de la enfermedad y la respuesta regenerativa. La ventaja sobre los métodos existentes o modelos animales es que pez cebra puede enseñarnos cómo un cerebro vertebrado puede regenerar naturalmente y así nos ayudan a tratar mejor las enfermedades neurodegenerativas humanas dirigiéndose NSPCs endógenas. Por lo tanto, el modelo de toxicidad del amiloide en el cerebro del pez cebra adulto puede abrir nuevas avenidas para la investigación en el campo de la neurología y la medicina clínica. Además, la ejecución simple de este método permite la evaluación experimental rentable y eficiente. Este manuscrito describe la síntesis y la inyección de péptidos de Aβ42 en cerebro de pez cebra.
Introduction
AD es una enfermedad progresiva crónica caracterizada por la pérdida de neuronas y sinapsis en la corteza cerebral1,2,3,4,5. Los sellos clásicos de neuropathological del anuncio son los depósitos de péptidos amiloides y formación de los ovillos enredos (NFTs)6. Las placas seniles, también conocido como placas amiloideas, están compuestas de péptidos amiloide-β (Aß) que forman estructuras de β-plisadas en el parénquima cerebral del5. La acumulación de Aβ42 en pacientes con EA tiene un papel temprano y crítico en la progresión de la enfermedad. Anuncio desencadena una cascada de eventos que llevan a disfunción sináptica y plasticidad deteriorada pérdida neuronal7,8,9,10.
El cerebro adulto del pez cebra teleósteos sirve como un excelente modelo para estudiar la regulación de la célula de vástago plasticidad11,12,13,14,15, 1617,de,18,19,20 y diversas enfermedades en el sistema nervioso central (SNC), incluyendo AD21,22,23 ,24. Debido a una gran variedad de métodos experimentales disponibles19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, estos estudios son informativos y factible. Pez cebra puede llenar el CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, en parte mediante el uso de programas moleculares activados después de la pérdida neuronal19,39,40,41,42,43, 44. Por lo tanto, establecer un modelo de enfermedad neurodegenerativa en el pez cebra puede ayudar a resolver las preguntas novela sobre biología Regenerativa de capacidad y células madre en cerebros vertebrados.
Recientemente, hemos desarrollado un modelo de la toxicidad del amiloide en cerebro de pez cebra adulto inyectando sintético Aβ42 péptidos (tabla 1)39. Esta inyección causa neurodegeneración fenotipos de patología del cerebro humano (p. ej., muerte celular, la activación microglial, degeneración sináptica y déficits de la memoria), que indica ese pez cebra puede ser utilizado para la obtención de neurodegeneración en cerebro de pez cebra, Aβ42 péptidos pueden ser detectados con los stainings de immunohistochemical y mecanismos moleculares de la regeneración en pez cebra adulto que CNS puede ser identificado39. En este protocolo, demostramos la inyección de péptidos sintéticos de amiloide en el cerebro de pez cebra con cerebroventricular inyección (CVMI) método27,39,45,46 para imitar la deposición amiloidea (figura 1). CVMI ofrece una forma novedosa de entregar los péptidos, que agregan a inyección como estructuras de β-hoja y ejercen toxicidad. Los péptidos se distribuyen uniformemente a través del cerebro, a la zona ventricular a lo largo del eje rostro caudal entero45. Además, este método permite analizar la respuesta morfológica y molecular de las NSPCs en cerebro de pez cebra adulto después de inclusiones amiloideas. Este tipo de estudios nos dará una idea para la reparación exitosa del cerebro en mamíferos. Nuestro método puede utilizarse para comprender el mecanismo molecular necesario de una respuesta exitosa regeneración después de los síntomas de AD-como para inducir la reposición de las neuronas perdidas y recuperación funcional.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los péptidos amiloides pueden modificarse para incluir variaciones de secuencia o varias etiquetas. Por ejemplo, se puede generar un péptido amiloide revuelto, y los péptidos pueden ser marcados con etiquetas fluorescentes en el N-terminal del extremo del péptido o etiquetados portador péptidos39. Del mismo modo, en el presente Protocolo, el péptido portador es el penetrar en la célula péptido TR debido a su eficacia para el transporte de carga profunda en el tejido cerebral del<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por DZNE y la Asociación Helmholtz (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) y DFG (KI1524/6) (CK); y por la Asociación de Leibniz (Sierra-2011-IPF-2) y el BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). También nos gustaría agradecer a Ulrike Hofmann para síntesis de péptidos y Nandini Asokan, Prayag Murawala y Elly Tanaka durante la filmación del procedimiento.
Materials
| Fmoc-protected amino acids | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N,N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 822299 | Fmoc deprotection reagent |
| Dichlormethane (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 106050 | Solvent |
| Formic acid (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 100264 | Buffer component for HPLC |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 808260 | Clevage Mixture reagent |
| Triisopropylsilane(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 233781 ALDRICH | Clevage Mixture reagent |
| Acetonitrile (for UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvent |
| Acetonitrile (for HPLC) | VWR International Ltd, England | 83639.320 | Solvent |
| Diethylether | VWR International Ltd, England | 23811.326 | Solvent for peptide precipitation |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, England | 0281-25G | Clevage Mixture reagent |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) | S30023 | Solid phase for SPPS |
| Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters | Intavis AG (Cologne, Germany) | 34.274 | Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 11806-50-N | Filteration of precipitated peptides |
| Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filteration for HPLC |
| Peptide Synthesizer | Intavis, Cologne, Germany | ResPep SL | Automated solid-phase peptide synthesizer |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) |
| PolymerX, bead size 10μm, 250×10 mm | Phenomenex Ltd. Germany | 00G-4328-N0 | Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column |
| Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Water purification system |
| Filtration Unit | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 16307 | Filtration unit for peptide precipitation |
| UPLC Aquity with UV Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50×2.1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Analytical C18 column |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany | 16706, 101542 | Lyophilizer with vaccum pump |
| Paradigm plate reader | Beckman Coulter | ||
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 821.472 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Needle | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
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