Toxicidade do Amyloid-β42 de modelagem e neurodegeneração no cérebro adulto de Zebrafish
Summary
Este protocolo descreve a síntese, caracterização e injeção de peptídeos monomérico amiloide-β42 para gerar toxicidade amiloide no zebrafish adulto para estabelecer um modelo de doença de Alzheimer, seguido de análise histológica e detecção de agregações.
Abstract
A doença de Alzheimer (AD) é uma debilitante doença neurodegenerativa em que acúmulo de amiloide tóxica-β42 peptídeos (Aβ42) leva à degeneração sináptica, inflamação, morte neuronal e déficits de aprendizagem. Os seres humanos não podem regenerar neurônios perdidos no caso de AD em parte devido à deficiente capacidade proliferativa das células tronco/progenitoras neurais (NSPCs) e neurogênese reduzida. Portanto, terapias regenerativas eficientes também devem aumentar a proliferação e neurogênica capacidade de NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) é um organismo regenerativo, e podemos aprender os programas moleculares básicos com o qual nós poderíamos projetar abordagens terapêuticas para combater AD. Por esta razão, a geração de um modelo AD-como no zebrafish era necessária. Usando nossa metodologia, podemos introduzir derivados sintéticos de peptídeo Aβ42 com capacidade de penetração de tecido do cérebro de adultos do zebrafish e analisar a patologia da doença e da resposta regenerativa. A vantagem sobre os métodos existentes ou modelos animais é que aquele zebrafish pode ensinar-nos como um cérebro de vertebrados pode regenerar naturalmente e, assim, ajudar-na tratar melhor as doenças neurodegenerativas humanas pela segmentação NSPCs endógenas. Portanto, o modelo de amiloide-toxicidade estabelecido no cérebro adulto zebrafish pode abrir novos caminhos para a investigação no campo da neurociência e da medicina clínica. Além disso, a simples execução desse método permite a avaliação experimental cost-effective e eficiente. Este manuscrito descreve a síntese e a injeção de Aβ42 peptídeos no cérebro de zebrafish.
Introduction
AD é uma doença progressiva crônica, caracterizada pela perda de neurônios e sinapses no córtex cerebral1,2,3,4,5. As características neuropatológicas clássicas de anúncio são a deposição de amiloides peptídeos e formação do tangles emaranhados (NFTs)6. Placas senis, também conhecido como placas amiloides, são compostas de peptides amyloid-β (Aβ) que formam estruturas de β-plissado no parênquima cerebral5. O acúmulo de Aβ42 em pacientes AD tem um papel inicial e crítico na progressão da doença. AD desencadeia uma cascata de eventos levando a perda neuronal7,8,9,10, plasticidade prejudicada e disfunção sináptica.
O cérebro adulto de teleósteos zebrafish serve como um excelente modelo para estudar o Regulamento de células-tronco plasticidade11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 e várias doenças no sistema nervoso central (CNS), incluindo AD21,22,23 ,24. Devido a uma vasta gama de métodos experimentais disponíveis19,20,25,26,,27,28,29, 30 , 31, estes estudos são informativas e viável. Zebrafish pode reabastecer o CNS13,15,32,33,34,35,36,37,, 38, em parte por meio de programas moleculares ativados após perda neuronal19,39,40,41,42,43, 44. Portanto, estabelecer um modelo de doenças neurodegenerativas no zebrafish pode ajudar a abordar questões romance sobre Biologia regenerativa de capacidade e células-tronco no cérebro de vertebrados.
Recentemente, desenvolvemos um modelo de toxicidade amiloide no cérebro adulto zebrafish injetando sintético Aβ42 peptídeos (tabela 1)39. Esta injeção causou neurodegeneração fenótipos reminiscentes de patologia do cérebro humano (por exemplo, morte celular, ativação microglial, degeneração sináptica e défices de memória), indicando o zebrafish pode ser usada para suscitar Neurodegeneração no cérebro de zebrafish, Aβ42 peptídeos podem ser detectados com colorações imuno-histoquímica e mecanismos moleculares de regeneração no zebrafish adulto que CNS pode ser identificado39. Neste protocolo, demonstramos a injeção de peptídeos sintéticos amiloides no cérebro de zebrafish usando um cerebroventricular injeção (CVMI) método27,39,,45,46 para imitar a deposição de amiloide (Figura 1). CVMI fornece uma nova maneira de entregar os peptídeos, que agregam mediante injeção como estruturas de β-folha e exercem a toxicidade. Os peptídeos são distribuídos uniformemente em todo o cérebro, direcionando a área ventricular ao longo do eixo rostro-caudal inteira45. Além disso, este método permite para analisar a resposta morfológica e molecular das NSPCs no cérebro adulto zebrafish inclusões amiloides a seguir. Tais estudos nos fornecerá uma visão para o reparo de cérebro bem sucedida em mamíferos. Nosso método pode ser usado para entender o mecanismo molecular necessário de uma resposta de regeneração bem sucedida após sintomas de AD para induzir reconstituição dos neurônios perdidos e recuperação funcional.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os peptídeos de amiloide podem ser modificados para incluir variações de sequência ou várias marcas. Por exemplo, um peptídeo de amiloide mexido pode ser gerado, e os peptídeos podem ser rotulados com etiquetas fluorescentes no N-terminal da extremidade do peptide ou marcados com transportadora peptídeos39. Da mesma forma, no presente protocolo, o peptídeo de transportadora é o célula-penetrante peptídeo TR por causa de sua eficácia para transporte de carga profunda para o tecido de c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo DZNE e Associação Helmholtz (VH-NG-1021), poucos, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) e DFG (KI1524/6) (CK); e pela Associação de Leibniz (Serra-2011-IPF-2) e BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Gostaríamos também de agradecer Ulrike Hofmann para síntese do peptide e Nandini Asokan, Prayag Murawala e Elly Tanaka ajuda durante as filmagens do procedimento.
Materials
| Fmoc-protected amino acids | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N,N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 822299 | Fmoc deprotection reagent |
| Dichlormethane (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 106050 | Solvent |
| Formic acid (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 100264 | Buffer component for HPLC |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 808260 | Clevage Mixture reagent |
| Triisopropylsilane(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 233781 ALDRICH | Clevage Mixture reagent |
| Acetonitrile (for UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvent |
| Acetonitrile (for HPLC) | VWR International Ltd, England | 83639.320 | Solvent |
| Diethylether | VWR International Ltd, England | 23811.326 | Solvent for peptide precipitation |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, England | 0281-25G | Clevage Mixture reagent |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) | S30023 | Solid phase for SPPS |
| Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters | Intavis AG (Cologne, Germany) | 34.274 | Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 11806-50-N | Filteration of precipitated peptides |
| Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filteration for HPLC |
| Peptide Synthesizer | Intavis, Cologne, Germany | ResPep SL | Automated solid-phase peptide synthesizer |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) |
| PolymerX, bead size 10μm, 250×10 mm | Phenomenex Ltd. Germany | 00G-4328-N0 | Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column |
| Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Water purification system |
| Filtration Unit | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 16307 | Filtration unit for peptide precipitation |
| UPLC Aquity with UV Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50×2.1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Analytical C18 column |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany | 16706, 101542 | Lyophilizer with vaccum pump |
| Paradigm plate reader | Beckman Coulter | ||
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 821.472 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Needle | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
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