Определение остаточного доноров эритроидных клеток-предшественников после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с Hemoglobinopathies
Summary
Количественная оценка полученных доноров клеток требуется контролировать приживления после трансплантации стволовых клеток у пациентов с hemoglobinopathies. Сочетание сортировки потока на основе цитометрии клеток, колонии формирования assay и последующий анализ короткие тандемные повторы могут быть использованы для оценки масштабов распространения и дифференциации прародителей в отсеке эритроидные.
Abstract
В значительной части пациентов после трансплантации костного мозга для талассемии основных или серповидно-клеточной анемии отмечается наличие неполной химеризма. Это замечание имеет огромные последствия, поскольку последующие терапевтических иммуномодуляция стратегии может улучшить клинические исходы. Условно полимеразная цепная реакция-анализ короткие тандемные повторы используется для идентификации химеризма в клетках крови доноров производные. Однако этот метод ограничен ядерных клеток и не могут различать между диссоциированных одноклеточных линий. Мы прикладной анализ короткие тандемные повторы течь гранулярных сортировка гемопоэтических предшественников клетки и сравнить это с анализом короткие тандемные повторы, полученные из выбранных взрыв формирование подразделения – эритроидных колоний, оба собранные из костей костного мозга. С помощью этого метода мы в состоянии продемонстрировать различные пролиферации и дифференцировки клеток донора в отсеке эритроидные. Эта техника имеет право завершить текущий мониторинг химеризма в трансплантации стволовых клеток Установка и таким образом может быть прикладной в будущем клинических исследований, исследования стволовых клеток и дизайн испытаний генной терапии.
Introduction
Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) является доступны только лечебный подход для различных врожденные генетические заболевания кроветворной системы, достижения безрецидивной выживаемости более чем 90% иначе сильно скомпрометирован и жизнь ограниченной пациентов1. Эффективность этого важного инструмента терапевтических оптимизирована путем ограничения токсичности пред- и после трансплантации схемы2, но также на мероприятия, направленные на поддержание стабильных трансплантата функция, которая количественно путем тщательного наблюдения за клетки донора производным3,4,5.
В общем полный химеризма (CC) подразумевает полная замена отсека lymphohematopoietic клетками донора производные, тогда как термин смешанные химеризма (MC) используется для доноров и получателей, полученных клетки одновременно присутствуют в различных пропорции. Сплит химеризма (SC) обозначает сосуществование смешанных химеризма наблюдается в одноклеточных линий, таких как эритроидные отсека. Оперативное определение статуса химеризма ТГСК имеет решающее значение, как это может помочь определить восприимчивы рецидивов заболевания и инициировать последующих иммуномодулирующих стратегии, такие как доноров лимфоцитов инфузии или сокращение иммунодепрессивных больных 6лечения.
Несколько методов были разработаны для мониторинга приживления после ТГСК. Isotyping иммуноглобулины и анализ цитогенетика имеют плохое чувствительность и ограничены в их способность обнаруживать полиморфизм,78. Введения флуоресцентных в situ гибридизация (рыба) может повысить чувствительность в химеризма мониторинга после ТГСК, но ограничивается секс несоответствие аллотрансплантантов9. В настоящее время является наиболее распространенным методом, используемым для обнаружения химеризма полимеразной цепной реакции (ПЦР) и основывается на электрофорез геля агарозы обычных-акриламид переменное число повторов тандем (VNTRs) или короткие тандемные повторы (СПО). Обычно используются количественного PCR способен обнаружить крайне небольшая доля остаточных доноров клеток после ТГСК. Основным ограничением исследований пока, что MC обнаружения ограничивается почти исключительно наличием ядерных клеток, а не зрелых эритроцитов, а именно клеток, что являются функционально важно для пациентов, пострадавших от hemoglobinopathies. У больных с различными группами крови стоит вспомнить, что cytofluorometric анализ способен идентифицировать химеризма в красных кровяных клетках путем использования моноклональных антител к антигенам эритроцитов ABO и C, c, D, E и e-10 , 11. разные, но очень интересные средства оценки химеризма эритроидные линии является сочетание потока гранулярных сортировки эритроидные предшественники и выбор различных типов эритроидные предшественники путем культивирования в колониеобразования анализов, После анализа12ул. Этот подход имеет возможность количественно относительные пропорции химеризма доноров и получателей помощи в отсеке эритроидные и могут быть использованы в стратегии для поддержания костного трансплантата.
Protocol
Representative Results
Discussion
Целью настоящего исследования является предоставить аудитории сочетание двух подходов для анализа химеризма доноров/получателей помощи в эритроидные предшественники после ТГСК больных лечение hemoglobinopathies: 1.) сортировки активирован флуоресценции клеток прародитель гемопоэтических к…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Regenbogen подчиняется Kinderkrebshilfe.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
