Rilevamento di cellule progenitrici eritroidi di donatore residua dopo trapianto di cellule staminali ematopoietiche per i pazienti con emoglobinopatie
Summary
È necessaria per monitorare attecchimento dopo trapianto di cellule staminali in pazienti con emoglobinopatie quantificazione delle cellule derivate dal donatore. Una combinazione di flusso cytometry-base cella ordinamento, analisi di formazione della Colonia e successiva analisi del tandem brevi ripetizioni possono essere utilizzati per valutare la proliferazione e il differenziamento dei progenitori nel vano degli eritrociti.
Abstract
La presenza di chimerismo incompleto è notata in una grande percentuale di pazienti dopo trapianto di midollo osseo per talassemia major o malattia di cellule di falce. Questa osservazione ha implicazioni tremende, come strategie di immunomodulazione terapeutica successiva possono migliorare il risultato clinico. Convenzionalmente, analisi reazione-basata catena della polimerasi di brevi ripetizioni in tandem è utilizzato per identificare il chimerismo in cellule di sangue donatore-derivate. Tuttavia, questo metodo si limita alle cellule nucleate e non può distinguere tra dissociate unicellulare lignaggi. Abbiamo applicato l’analisi di brevi ripetizioni in tandem di cellule progenitrici ematopoietiche ordinato cytometric di flusso e confrontato questo con l’analisi di brevi ripetizioni in tandem ottenuti da unità selezionata burst-forming – colonie eritroidi, entrambi raccolti dall’osso midollo osseo. Con questo metodo siamo in grado di dimostrare la diversa proliferazione e differenziazione delle cellule donatrici nel vano degli eritrociti. Questa tecnica è idonea per la realizzazione di monitoraggio della corrente di chimerismo nel trapianto di cellule staminali impostazione e quindi può essere applicato in futuro studi, ricerca sulle cellule staminali e progettazione di prove di terapia genica.
Introduction
Trapianto di cellule staminali emopoietiche allogeniche (HSCT) è l’approccio curativo solo disponibile per una varietà di disordini genetici innati del sistema ematopoietico, realizzando i tassi di sopravvivenza libera da malattia superiore al 90% per altrimenti altamente compromessa e vita limitata pazienti1. L’efficacia di questo importante strumento terapeutico è stato ottimizzato limitando la tossicità di pre- e post-trapianto i regimi2, ma anche di interventi volti a sostenere la funzione dell’innesto stabile, che è quantificato da attento monitoraggio dei donatore-derivate cellule3,4,5.
In generale, chimerismo completo (CC) comporta la sostituzione totale del vano linfoematopoietico dalle cellule donatore-derivati, considerando che il termine mixed chimerism (MC) è usato quando le cellule derivate dal donatore e destinatario sono contemporaneamente presenti in vari proporzioni. Chimerismo Split (SC) denota la coesistenza del chimerism misto osservata in lignaggi unicellulare, come ad esempio nel comparto degli eritrociti. Rapida determinazione dello status di chimerismo dopo HSCT è critica, come può aiutare a identificare i pazienti suscettibili per ricaduta di malattia e immunomodulatori successive avviare strategie, come infusioni erogarici del linfocita o riduzione di immunosoppressori terapie6.
Diversi metodi sono stati sviluppati per il monitoraggio attecchimento dopo HSCT. Isotyping delle immunoglobuline e l’analisi di citogenetica hanno scarsa sensibilità e sono limitati nella loro capacità di rilevare il polimorfismo7,8. L’introduzione di ibridazione fluorescente in situ (FISH) può migliorare la sensibilità nel chimerismo monitoraggio dopo HSCT, ma è limitata al sesso-mal adattato allotrapianti9. Attualmente, reazione a catena della polimerasi (PCR) è il metodo più diffuso utilizzato per rilevare chimerismo e si basa su elettroforesi su gel di agarosio-acrilammide convenzionale di ripetizioni in tandem di numero variabile (VNTR) o ripetizioni in breve tandem (STRs). Abitualmente utilizzati PCR quantitativa è in grado di rilevare un’estremamente piccola proporzione delle cellule erogarici residua dopo HSCT. La limitazione principale degli studi finora è che MC rilevamento è limitata quasi esclusivamente alla presenza di cellule nucleate, piuttosto che sugli eritrociti maturi, vale a dire le cellule che sono funzionalmente cruciale per i pazienti affetti da emoglobinopatie. In pazienti con gruppi sanguigni diversi, vale la pena ricordare che l’analisi cytofluorometric è in grado di identificare il chimerismo nei globuli rossi utilizzando anticorpi monoclonali diretti verso antigeni eritrocitari di ABO e C, c, D, E ed e10 , 11. un mezzo diverso, ma molto interessante valutare chimerismo nella stirpe degli eritrociti è la combinazione di flusso cytometric l’ordinamento dei progenitori eritroidi e selezione di vari tipi di cellule progenitrici eritroidi coltivando in saggi clonogenici, seguita dall’analisi di STR12. Questo approccio è in grado di quantificare le proporzioni relative di chimerismo donatore-versus-destinatario nel vano degli eritrociti e può essere utilizzato nella strategia per sostenere il trapianto di midollo osseo.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’obiettivo di questo studio è quello di fornire al pubblico una combinazione dei due approcci per l’analisi di chimerismo donatore/ricevente nei progenitori eritroidi dopo HSCT nei pazienti trattati per emoglobinopatie: 1.) l’ordinamento fluorescenza-attivato delle cellule di cellule progenitrici ematopoietiche nei campioni di midollo osseo, seguiti dall’analisi di brevi ripetizioni in tandem e 2.) unità formanti colonie di crescita delle cellule del midollo osseo, classificazione delle colonie in vari tipi di cellule…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
