Summary

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

Published: July 26, 2017
doi:

Summary

Burada, insan miyoblastlarının saf bir popülasyonunu yetişkin kas dokusundan elde etmek için bir metodoloji tarif ederiz. Bu hücreler, in vitro iskelet kası diferansiasyonunu incelemek ve özellikle Ca 2+ sinyallemeyle ilgili proteinleri incelemek için kullanılırlar.

Abstract

Uydu hücreleri (SC), kas liflerinin plazma membranı ile çevresindeki bazal laminat arasında bulunan kas kök hücreleridir. Kas rejenerasyonu için gereklidirler. İskelet kaslarında sıklıkla görülen yaralanmalar üzerine SC'ler harekete geçirilir. Myoblastlar olarak çoğalıyor ve kas lezyonlarını onarmak için ayırt ediliyorlar. Kas farklılaşması sırasında gerçekleşen birçok olay arasında, sitosolik Ca 2+ sinyalleri büyük önem taşır. Bu Ca2 + sinyaller hem de hücre dışı alanı Ca2 + girişi, özellikle depo çalışan Ca2 + girişi (SOCE) itibaren, iç Ca2 + depolardan Ca + 2 serbest ortaya çıkar. Bu makale, ortopedik ameliyattan sonra toplanan kas örneklerinden saf bir insan miyoblast popülasyonunu elde etmek için kullanılan bir metodu açıklamaktadır. Doku mekanik ve enzimatik olarak sindirilir ve hücreler çoğaltılır ve daha sonra spesifikasyonların varlığına göre akış sitometrisi ile sıralanırFik membran belirteçleri. Elde edilen insan miyoblastları büyütülür ve büyüme faktörlerini kültür ortamından uzaklaştırarak ayırt etmeyi taahhüt eder. Spesifik transkripsiyon faktörlerinin ekspresyon seviyeleri ve in vitro immünofloresans, kontrol koşullarında ve Ca 2 + sinyallemeyle ilgili proteinleri susturmadan sonra miyojenik farklılaşma sürecini değerlendirmek için kullanılır. Son olarak, SACE'nin güvenilir ve tekrarlanabilir ölçümlerini sağlayan bir ratiometric Ca 2+ probu olarak Fura-2'nin kullanımını ayrıntılarıyla açıkladık.

Introduction

İnsan iskelet kasları, miyojenik öncü hücrelerin kaynaşmasından kaynaklanan kontraktil, çok çekirdekli kas liflerinden oluşan gruplardan oluşur. İskelet kası, miyofibarların plazma membranı (sarcolemma) ile bazal lamina arasında bulunan iskelet kası kök hücreleri olan SC'lerin varlığı nedeniyle hasardan sonra yeniden oluşma kapasitesine sahiptir. Yaralanmamış kasında, SC'ler çoğunlukla sessiz bir durumda bulunur. Mekanik stres veya yaralanmaya tepki olarak, SC'ler aktifleştirilir (miyoblastlar), çoğalır ve yeni miyofiberleri oluşturmak için ya da SC havuzu 1 , 2'yi doldurmak için kendi kendini yenilemek üzere farklılaşır. Yıllar geçtikçe, SC'leri ve yavrularını (miyoblastları) iskelet kası biyopsilerinden izole etmek için çeşitli teknikler geliştirildi. Bu hücreler üzerinde ifade edilen hücre yüzey markörlerinin daha iyi anlaşılması ve floresans ile aktive edilmiş hücre sınıflandırması (FACS) metodolojisine 3 ile, 4 , 5 , şimdi insan kasları saf kas popülasyonlarını kas örneklerinden izole etmek mümkündür.

Kalsiyum sinyali iskelet kası gelişimini, homeostazı ve yenilenmeyi düzenler. Özellikle, SOCE adlandırılan hücre-içi stokunun tükenmesi sonra aktive edilir Ca2 + girişi, bu işlemler için büyük önem 6 taşımaktadır. Hücre uyarımı üzerine, endo / sarkoplazmik retikulumdaki Ca 2+ seviyesi (ER / SR) azalır ve bu da, Ca 2+ girişinin ER / SR 7'yi tekrar doldurmasına izin veren plazma membranı Ca 2+ kanallarını harekete geçirir. SOCE'ye katılan iki ana protein, ER / SR Ca 2+ -gören stromal etkileşim molekülü 1 (STIM1) proteini ve plazma membranı Ca2 + kanalı Orai1'dir. İskelet kası bu iki proteini ve aynı ailelerin diğer proteinlerini bol miktarda ifade eder (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 ve birkaç Ca 2+ geçirgen olmayan geçici alıcı potansiyel kanonik (TRPC) ailesi kanalları 10 , 11 , 12 , 13 . SOCE yolu boyunca Ca 2+ girişi, kas oluşumu / rejenerasyonu için çok önemlidir 14 . STIM1 veya Orai1 proteinlerinin mutasyonları kas hipotoni 15 esas açan kas fonksiyonu üzerinde zararlı etkileri vardır. SOCE bozukluğu olan hayvan modelleri, azaltılmış kas kütlesini ve kuvvetini, aynı zamanda artmış yorgunluk 6 , 16 , 17 ile birlikte gösterir . Belirtildiği gibi, diğer STIM ve Orai proteinleri ve birçok TRPC kanalı iskelet kasında eksprese edilir ve şimdiye kadar ilgili rolleri belirlenememiştir. D'yi çalarakKendi ifade seviyelerine sahip oldukları için, SOCE'deki etkilerini ve insan iskelet kası farklılaşması sırasındaki rollerini araştırmak mümkündür.

SOCE ölçümü iki farklı yaklaşımla yapılabilir: elektrofizyolojik güncel kayıtlar ve Ca 2+ ölçümleri. Elektrofizyoloji, ilgi akımını ve buna bağlı elektrofizyolojik imzayı ölçtüğünden kesinlikle daha doğrudan bir yöntemdir. Bununla birlikte, bu tekniğin kas hücrelerine uygulanması çok zordur çünkü esas olarak kas hücrelerinin büyüklüğü ve endojen SOCE akımının küçük boyutu. Sitosolik Ca 2+ görüntüleme teknik açıdan çok erişilebilir, ancak sitosolde ölçülen Ca 2+ seviyesi hem Ca 2+ girişini hem de hücrenin yeniden dışarı pompalamasını ya da iç depolarda yansıtıldığından önlem daha dolaylı.

Mikoblastların küçük insan iskeletinden izole edilmesini içeren bir metodolojiEnzimatik sindirim, amplifikasyon ve FACS sonrası etal kasa bu makalede açıklanmıştır. Zamanla farklılaşan belirteçlerin ekspresyonunu izleyen kas farklılaşması ve immünofloresan protokolü işlemi 18'de tanımlanmıştır. Son olarak, SOCE'nin ölçümü ve Ca 2+ sinyal verme ve iskelet kasının diferansiyasyonunda farklı iyon kanallarının rolü açıklanmaktadır.

Protocol

Ortopedik cerrahi sırasında sağlıklı hastalarda cerrahi atık olarak insan kas örnekleri (semitendinöz kaslardan alınan dokular) toplandı. İnsan çalışmasıyla ilgili tüm yöntemler, İsviçre Düzenleyici Sağlık Otoriteleri'nin yönergelerine ve düzenlemelerine uygun olarak ve İsviçre'deki Cenevre Kanton Yetkilileri'nden (Protokol CER n ° 12-259) Komisyon Yasası tarafından onaylanmıştır. . Bilgilendirilmiş ve yazılı onaylar, çalışmaya katılan tüm yetişkinlerden elde edildi. …

Representative Results

Bir insan kas örneğinin enzimatik ayrışmasından sonra, hücreler GM'de amplifiye edildi. CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- hücreleri olarak tanımlanan insan miyoblastları FACS'den sonra elde edildi. Myoblastlar, analiz edilen popülasyonun% 60'ından fazlasını temsil etti ( Şekil 1 ). Primer insan miyoblastları yeniden oluşturuldu, konfluansa kadar çoğaltıldı ve 48 saat DM'de kültürlendi. Transkripsiyon faktörü MEF2 ve kas spesifik protein miyozi…

Discussion

Yetişkin iskelet kasından insan miyoblastlarının izolasyonu ve kültürü, kas farklılaşması ve kas yenilenmesini incelemek için in vitro bir model sunar. Bu yazıda, insan miyoblastlarının yüksek verimliliğini basit ve maliyet-sınırlı şekilde arındırmaya olanak tanıyan bir protokol sunuyoruz. Buna ek olarak, bu teknik, izole edilen miyoblastların yüzdesi ve miyojenik farklılaşma verimi açısından güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Nitekim …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (hibe numarası 310030-166313), "Vakıf Marcel Levaillant" ve "Fondation pour la recherche osteo-articulaire" başlıklı "Fondation Suisse reourcheurs sur les maladies musculaires" tarafından desteklendi.

Materials

Ham’s F10 ThermoFisher Scientific 31550-023
FCS ThermoFisher Scientific 10270-106 Lot 41G5532K
BSA Sigma O5482
fetuin Sigma F3385
EGF Corning 354001
Dexamethansone Sigma D1756
Insulin Sigma I9278
Creatine Sigma 27900
Pyruvate Sigma P4562
Uridine Sigma U3003
Gentamycin ThermoFisher Scientific 15710-049
Trypsin-EDTA 0.05% ThermoFisher Scientific 25300-062
70 μm cell strainer Falcon 352350
40 μm cell strainer Falcon 352340
Falcon 50 ml tube Falcon 352070
Falcon 15 ml tube Falcon 352096
Falcon 5 ml tube (FACS) Falcon 352058
Culture medium: OPTI-MEM ThermoFisher Scientific 31985-047
Transfectant reagnt: RNAiMax ThermoFisher Scientific 1756064
PBS ThermoFisher Scientific 14190-094
Mounting medium Fluka 10981
Mouse anti-MyHC * DSHB MF20  concentrate
Mouse anti-myogenin BD Pharmigen 556358
Rabbit anti-MEF2 Santa Cruz Biotech C-21
Goat anti-mouse Alexa488 ThermoFisher Scientific A11029
Goat anti-rabbit Alexa 546 ThermoFisher Scientific A11035
Mouse anti human CD56-Alexa488 BD Pharmingen 557699
Mouse anti human CD146-PECy7 BD Pharmingen 562135
Mouse anti human CD45-PE-CF594 BD Pharmingen 562279
Mouse anti human CD34-APC BD Pharmingen 345804
Mouse anti human CD144-PE BD Pharmingen 560410
Alexa Fluor 488 mouse IgG1k BD Pharmingen 557702
PECy7 mouse IgG1k BD Pharmingen 557872
PE-CF594 mouse IgG1k BD Pharmingen 562292
APC mouse IgG1k BD Pharmingen 550854
PE mouse IgG1k BD Pharmingen 556650
DAPI Sigma D9542 CAUTION:  toxic compound
Paraformaldehyde Fluka 762400
Fura-2 AM ThermoFisher Scientific F1201
Pluronic F-127 ThermoFisher Scientific P3000MP
Thapsigargin Sigma T9033 CAUTION : toxic compound 
Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 Molecular Device
* : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. 

References

  1. Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
  2. Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
  3. Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
  4. Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
  5. Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
  6. Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
  7. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  8. Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
  9. Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
  10. Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
  11. Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
  12. Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
  13. Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
  14. Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
  15. Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
  16. Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
  17. Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
  18. Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
  19. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  20. Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
  21. Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
  22. Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
  23. Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
  24. Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).

Play Video

Cite This Article
Laumonier, T., Koenig, S., Saüc, S., Frieden, M. Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement. J. Vis. Exp. (125), e55918, doi:10.3791/55918 (2017).

View Video