中規模の<em>ショウジョウバエ</em>プロテオーム実験のための胚抽出物

遺伝学的スクリーニング、そして最近では、ゲノムアプローチが生物学的機能の研究に革命をもたらしている。しかしながら、重要な細胞情報は、タンパク質および相互作用するパートナーの集合体にコードされている。伝統的な遺伝子改変スクリーニングは、律速経路成分を同定し、間接的な相互作用を回復することができるが、プロテオームアプローチの強さは、目的のタンパク質の完全な即時相互作用ネットワークを同定する能力にある。したがって、プロテオミクスは生物学的システムを研究する貴重な直交方法であり、ゲノミクス、トランスクリプトミクス、伝統的な遺伝子スクリーニングを補完するものです。 Affinity purification-mass spectrometry（AP-MS）は、細胞および組織^1,2の固有環境におけるタンパク質 – タンパク質相互作用（PPI）を研究する強力なアプローチであることが証明されています。この方法は、特定の開発における直接的または間接的な相互作用の同定を可能にする様々な発生経路における複数の新規PPIを同定するために首尾よく使用されている（参考文献^1で概説されている）。 PPI研究の明白な成功にもかかわらず、それらの大部分は、目的の「餌」タンパク質が過剰発現された培養細胞で実施されている。細胞培養においてPPIを研究することには2つの問題がある：第1に、特定の細胞株は、特定のタンパク質の発現の欠如のために完全な相補性を提供しない可能性がある。第二に、このような分析に通常用いられる高い過剰発現は、タンパク質の誤った折り畳みまたは誤った陽性の相互作用の同定のような人工物につながる可能性がある。

インビボで PPI を分析することによって、これらの制限の両方を克服することができる。そのような実験における限定的な工程は、タンパク質複合体を精製するための出発物質の利用可能性である。 ショウジョウバエmelanogasterは、機能解析のモデルとして長く使用されてきた最近、インビボで PPIを研究するための優れたシステムであることも示されています。 ショウジョウバエの胚発生は、胚を大量に容易に採取することができ、また胚発生の過程で大部分の遺伝子（> 88％）が発現され、関連性の高いin vivo環境を提供するためPPIを研究するのに特に魅力的な組織型であるPPIs ³ 。

伝統的に、ハエの生化学的研究は、機能的転写ライセートを精製するために必要なものなど、非常に大規模な胚コレクション（100〜150g）を利用している4,5。これまでのショウジョウバエの AP-MS研究では、タンデムアフィニティ精製（TAP）などの2ステップ精製手法に依存し、各ステップ⁶で材料が喪失したため、大量の胚が必要でした（5~10g）。大物高価な（商業的に購入された場合）および維持管理に時間がかかることがあり、7,8,9を清潔にすることができる、大きな集団ケージに胚コレクションを設置する必要があった。

シングルステップ親和性精製アプローチの開発における最近の進歩、ならびに質量分析計の高感度化は、出発物質の必要量を一桁減少させた。ストレプトアビジン結合ペプチド（SBP）または緑色蛍光タンパク質（GFP）などのタグを使用し、1g未満の胚から開始することにより、餌タンパク質および相互作用する成分の量を、質量分析^10,11 。

ここに提示された議定書の目標は、研究者が過度に私はインビボでのPPIの生化学分析に対する認識された障壁となった。そのためには、 ショウジョウバエの胚を中程度（0.5〜1g）で採取するための簡単で安価な手順を提供し、続いてAP-MSまたは他のアプローチによる後の分析に適した全細胞タンパク質抽出物の一段階調製を行う。私たちの方法は、どの実験室でも簡単に作成できるカスタムメイドの1Lまたは5L集団ケージの使用に依存しています。さらに、ここに提示された抽出条件は、培養細胞およびインビボの両方において、10,12,13,14,15,16,17のいくつかの研究で検証されている。