Preparación a mediano plazo de<em> Drosophila</em> Extractos de embriones para experimentos proteómicos
Summary
El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque sencillo y barato para recolectar embriones de Drosophila a escala media (0,5-1 g) y preparar extractos de proteínas que pueden ser utilizados en aplicaciones proteómicas aguas abajo, tales como la purificación por afinidad-espectrometría de masas (AP-MS ).
Abstract
El análisis de las interacciones proteína-proteína (IPP) se ha convertido en un enfoque indispensable para estudiar los procesos y mecanismos biológicos, como la señalización celular, el desarrollo del organismo y las enfermedades. A menudo es deseable obtener información PPI utilizando material in vivo , para obtener la visión más natural e imparcial de las redes de interacción. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es una excelente plataforma para estudiar PPIs in vivo , y se presta a enfoques sencillos para aislar material para experimentos bioquímicos. En particular, los embriones de mosca de la fruta representan un tipo conveniente de tejido para estudiar los IBP, debido a la facilidad de recolección de animales en esta etapa de desarrollo y el hecho de que la mayoría de las proteínas se expresan en embriogénesis, proporcionando un entorno relevante para revelar la mayoría de los IBP. Aquí presentamos un protocolo para la recogida de embriones Drosophila a escala media (0,5-1 g), que es una cantidad ideal para una amplia gama deAplicaciones proteómicas, incluyendo análisis de PPIs por purificación por afinidad-espectrometría de masas (AP-MS). Describimos nuestros diseños para jaulas de 1 L y 5 L para colecciones de embriones que pueden ser instaladas fácil y económicamente en cualquier laboratorio. También proporcionamos un protocolo general para la recolección de embriones y la extracción de proteínas para generar lisados que pueden ser utilizados directamente en aplicaciones descendentes como AP-MS. Nuestro objetivo es proporcionar un medio accesible para que todos los investigadores lleven a cabo los análisis de los IPP in vivo .
Introduction
Las pantallas genéticas y, más recientemente, los enfoques genómicos han revolucionado el estudio de las funciones biológicas. Sin embargo, la información celular importante se codifica en proteínas y su conjunto de socios que interactúan. Mientras que las pantallas modificadoras genéticas tradicionales pueden identificar componentes de vías limitantes y recuperar interacciones indirectas, la fortaleza de los enfoques proteómicos reside en su capacidad para identificar redes de interacción inmediata completas de proteínas de interés. La proteómica es, pues, un valioso método ortogonal para estudiar los sistemas biológicos y complementa la genómica, la transcriptómica y las pantallas genéticas tradicionales. La purificación de afinidad-espectrometría de masas (AP-MS) ha demostrado ser un poderoso enfoque para estudiar las interacciones proteína-proteína (IPP) en su entorno nativo en las células y tejidos [ 1 , 2] . Este método permite la identificación de interacciones directas o indirectas en un desarrollo específicoAl estadios o contextos de tejido, y se ha utilizado con éxito para identificar múltiples nuevos PPIs en una variedad de vías de desarrollo (revisado en la referencia 1 ). A pesar del éxito indiscutible de los estudios de PPI, la mayoría de ellos se han llevado a cabo en células cultivadas, en las que se sobreexpresaron las proteínas de "cebo" de interés. Hay dos problemas con el estudio de los IBP en el cultivo de células: en primer lugar, una línea celular específica puede no proporcionar un complemento completo de interacciones debido a la falta de expresión de ciertas proteínas. En segundo lugar, la sobreexpresión alta normalmente empleada en tales análisis podría conducir a artefactos tales como el replanteo de proteínas o la identificación de interacciones positivas falsas.
Ambas limitaciones pueden ser superadas analizando PPI in vivo . Un paso limitante en tales experimentos es la disponibilidad del material de partida para purificar complejos de proteínas. Drosophila melanogaster se ha utilizado durante mucho tiempo como un modelo para el análisis funcionalSis, y recientemente también se ha demostrado ser un excelente sistema para el estudio de PPIs in vivo . La embriogénesis de Drosophila representa un tipo de tejido particularmente atractivo para estudiar los IBP, ya que los embriones pueden ser fácilmente recolectados en grandes cantidades, y también porque la mayoría de los genes (> 88%) se expresan durante la embriogénesis, proporcionando así un rico entorno in vivo para detectar IPP 3 .
Tradicionalmente, los estudios bioquímicos en moscas utilizaron colecciones de embriones a gran escala (100-150 g), como las necesarias para purificar los lisados transcripcionales funcionales [ 4 , 5] . Estudios previos de AP-MS en Drosophila también requerían grandes cantidades de embriones (5-10 g), porque dependían de un enfoque de purificación en dos etapas como la purificación de afinidad en tándem (TAP), con la consiguiente pérdida de material en cada paso 6 . Gran cantidadSt de material de partida requirió la creación de colecciones de embriones en grandes jaulas de población, que pueden ser costosas (cuando se compran comercialmente) y consumir mucho tiempo para mantener y limpiar 7 , 8 , 9 .
Los avances recientes en el desarrollo de enfoques de purificación por afinidad de un solo paso, así como la sensibilidad creciente de espectrómetros de masas, han reducido la cantidad necesaria de material de partida en un orden de magnitud. Usando etiquetas tales como el péptido de unión a la estreptavidina (SBP) o la proteína fluorescente verde (GFP) y partiendo de menos de 1 g de embriones, es posible aislar las cantidades de la proteína cebo y los componentes interactivos que serían suficientes para la identificación por Espectrometría de masas 10 , 11 .
El objetivo del protocolo presentado aquí es ayudar a los investigadores aMe una barrera percibida para el análisis bioquímico de PPIs in vivo . Con este fin, proporcionamos un procedimiento sencillo y económico para recoger embriones de Drosophila a escala media (0,5-1 g), seguido de una etapa de preparación de extractos de proteínas de células enteras que son adecuados para el análisis posterior por AP-MS u otros enfoques . Nuestro método se basa en el uso de jaulas personalizadas de 1-L o 5-L que pueden ser producidas fácilmente por cualquier laboratorio. Además, las condiciones de extracción presentadas aquí han sido validadas en varios estudios, tanto en células cultivadas como in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado aquí es un procedimiento simple y general para establecer jaulas de población de Drosophila a escala media y hacer extractos de proteína de células enteras de embriones. Los extractos resultantes pueden usarse en una variedad de aplicaciones aguas abajo, tales como la purificación de complejos de proteínas sobre resinas de afinidad. Es crítico realizar los pasos de extracción en hielo y utilizar una fuerte inhibición de la proteasa, para minimizar la degradación de la proteína…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a los miembros del laboratorio de Veraksa comentarios útiles sobre el manuscrito y sugerencias para mejorar el protocolo. AV fue apoyado por el NIH subvenciones GM105813 y NS096402. LY recibió el apoyo de la Universidad de Massachusetts Boston Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship.
Materials
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
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