Summary

ניתוח אינטראקציות חלבון חלבון שיתוף לוקליזציה בין רכיבי פערים, צמודים, ו adherens צמתים Murine בלוטות החלב

Published: May 30, 2017
doi:

Summary

צמתים בין-תאיים הם דרישות עבור פונקציות ספציפיות של בלוטת החלב והתפתחותן. כתב היד מספק פרוטוקול מפורט לחקר האינטראקציות בין חלבונים לחלבון (PPI) לבין שיתוף לוקליזציה באמצעות בלוטות החלב Murine. טכניקות אלה מאפשרות לחקור את הדינמיקה של הקשר הפיזי בין צמתים בין-תאיים בשלבי התפתחות שונים.

Abstract

אינטראקציות תא סלולרי תפקיד מרכזי בשמירה על שלמות הרקמה ואת המכשול בין תאים שונים של בלוטת החלב. אינטראקציות אלה מסופקות על ידי חלבונים גנטיים המרכיבים נקסוס בין תאים סמוכים. מיצוקלציה של חלבון פונקציונאלי וירידה באסוציאציות פיזיות עם השותפים המחייבים שלהם עלולה לגרום לאובדן תפקוד, וכתוצאה מכך לתפקוד איברים. לכן, זיהוי לוקליזציה של חלבונים וחלבוני חלבונים (PPI) ברקמות הרגילות והמחלות, חיוניים למציאת עדויות ומנגנונים חדשים המביאים להתפתחות מחלות או שינויים במעמד ההתפתחותי. כתב היד מציג שיטה דו-שלבית להערכת PPIs בבלוטות החלב של Murine. בפרוטוקול סעיף 1, שיטה לבצע co- אימונופלורסנציה (שיתוף IF) באמצעות נוגדנים שהועלו נגד חלבונים של עניין, ואחריו נוגדנים משניים שכותרתו עם fluorochromes, מתואר. למרות שיתוף שיתוף IFבגלל ההוכחה של קרבת החלבונים, היא מאפשרת ללמוד את האינטראקציות הגופניות שלהם. לכן, פרוטוקול מפורט עבור שיתוף immunoprecipitation (שיתוף IP) מסופק בסעיף פרוטוקול 2. שיטה זו משמשת כדי לקבוע את האינטראקציות הגופניות בין חלבונים, מבלי לאשר אם אינטראקציות אלה הן ישירות או עקיפות. בשנים האחרונות, Co-IF ו- co-IP טכניקות הוכיחו כי רכיבים מסוימים של צמתים בין תאגידים שיתוף וליצור אינטראקציה יחד, יצירת תלויי שלב nexuses הגדילה המשתנים במהלך התפתחות בלוטת החלב.

Introduction

התפתחות בלוטת החלב ופיתוח מתרחשת בעיקר לאחר הלידה. איבר זה מתחדד ללא הרף לאורך כל חיי הפוריות של יונק 1 . האפיתל בבלוטת החלב הבוגרת מורכבת משכבה פנימית של תאי אפיתל לומינליים ושכבה חיצונית של תאים ביזליים, המורכבים בעיקר מתאי מיופתיטליים, מוקפים בקרום מרתף 2 . לבדיקה טובה על מבנה בלוטת החלב ופיתוח, הקורא יכול להתייחס Sternlicht 1 . תאים תא אינטראקציות דרך הפער (GJ), הדוק (TJ), והצמדות (AJ) צמתים הדרושים להתפתחות תקינה ותפקוד של בלוטה 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . המרכיבים העיקריים של צמתים אלה בלוטת החלב Murine הם Cx26, Cx30, Cx32, ו Cx43 (GJ); קלודין -1, -3, -4, -7 וZO-1 (TJ); ו E-cadherin, P-cadherin, ו β-catenin (AJ) 7 , 8 . רמות הביטוי של אלה חלבונים ג 'וניקט שונים להשתנות באופן תלוי שלב במהלך התפתחות בלוטת החלב, מה שמציע אינטראקציה תא תא אינטראקציה הדרישות 9 . GJ, TJ ו- AJ קשורים באופן מבניים ופונקציונליים ומקיפים חלבונים מבניים או רגולטוריים אחרים לאתרים הסמוכים של תאים סמוכים, ובכך יוצרים קשר גנטי. ההרכב של הקשר הג'ונקטי יכול להשפיע על גישור עם cytoskeleton הבסיסית, כמו גם חדירות ויציבות nexus, ולכן יכול להשפיע על הפונקציה של בלוטת 8 , 9 , 10 , 11 . המרכיבים של צמתים בין תאים המתגוררים nexuses פונקציונלי או אינטראקציה אחד עם השני ב difבשלבים התפתחותיים של התפתחות בלוטת החלב נותחו לאחרונה באמצעות שיתוף immunofluorescence (שיתוף IF) ושיתוף אימונופרסיפיטיון (שיתוף IP) 9 . בעוד טכניקות אחרות מאפשרות להעריך את הקשר הפונקציונלי בין חלבונים, שיטות אלו אינן מוצגות בכתב היד הזה.

כאשר חלבונים פועלים רק לבדם לתפקוד, לימוד אינטראקציות בין חלבונים לחלבון (PPI), כגון טרנספורמציות אותות ומפליות ביוכימיות, הוא חיוני לחוקרים רבים ויכול לספק מידע משמעותי על תפקוד החלבונים. Co-IF וניתוח מיקרוסקופי לעזור להעריך כמה חלבונים החולקים את אותו חלל תת-תאי. עם זאת, מספר מטרות מוגבל על ידי נוגדנים, אשר חייב להיות הרים בעלי חיים שונים, ועל ידי גישה מיקרוסקופ confocal מצויד לייזרים שונים אורך גלאי ספקטרלי עבור ריבוב. Co-IP מאשרת או מגלה זיקה גבוהה פיזית אינטראקציות betwEen שני חלבונים או יותר המתגוררים בתוך קומפלקס חלבון. למרות הפיתוח של טכניקות חדשניות, כגון העברת אנרגיה תהודה הקרינה (סריג) 12 ו assay קשירת הקרבה (PLA) 13 , אשר יכול לזהות בו זמנית את לוקליזציה ואינטראקציות של חלבונים, שיתוף IP נשאר טכניקה נאותה ובמחיר סביר ללמוד אינטראקציות בין חלבונים אנדוגניים.

שיטת צעד אחר צעד המתוארת בכתב יד זה יקל על המחקר של לוקליזציה חלבון PPIs להצביע על מלכודות להימנע בעת חקר PPIs אנדוגני בבלוטות החלב. המתודולוגיה מתחילה בהצגת הליכי השימור השונים לרקמות הנדרשות לכל טכניקה. חלק 1 מציג כיצד ללמוד חלבון שיתוף לוקליזציה בשלושה שלבים: 1) חתך של בלוטות החלב, ii) פעמיים או משולשת תיוג של חלבונים שונים באמצעות טכניקה שיתוף IF, ו- iii) הדמיה שללוקליזציה של חלבונים. חלק 2 מראה כיצד להאיץ חלבון אנדוגני ולזהות חלבונים אינטראקציה שלה בשלושה שלבים: i) הכנה lysate, ii) immunoprecipitation חלבון עקיף, ו- iii) זיהוי שותף מחייב על ידי SDS-PAGE כתם המערבי. כל צעד של פרוטוקול זה הוא מותאם עבור מכרסמים בלוטות הבלוטות החלב ומייצר באיכות גבוהה, ספציפי, תוצאות לשחזור. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כנקודת מוצא ללימודי PPI ברקמות אחרות או שורות תאים.

Protocol

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים ששימשו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של האוניברסיטה (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada). 1. זיהוי חלבון שיתוף לוקליזציה מ רקמות לשקופיות מי…

Representative Results

כדי לקבוע אם GJ, AJ, ו TJ רכיבים יכולים לתקשר יחד בלוטת החלב, co-IF מבחני בוצעו לראשונה. Cx26, חלבון GJ, ו- β-Catenin, חלבון AJ, נבדקו באמצעות נוגדנים ספציפיים וגילו באמצעות נוגדנים של עכבר פלואורופורי-מצומדות (647, ירוק, pseudocolor) ועז-568 (אדום), בהתאמה ( איור 1B ו- <st…

Discussion

תאים תאים אינטראקציות באמצעות צמתים נדרשים לתפקוד תקין ופיתוח של איברים רבים, כגון בלוטת החלב. מחקרים הראו כי חלבונים פונקציונליים יכולים לווסת את הפונקציה ואת היציבות של אחד אחר ולהפעיל transduction האות על ידי קשירה זה לזה בקרום התא 10 . הפרוטוקולים שהוצגו ב?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

IP ממומן על ידי מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של מענק קנדה (NSERC # 418233-2012); פונדס דה Recherche du Québec-Santé (FRQS), פרס קריירה לסרטן השד של קוובק, ומענק למנהיגים מייסד הקרן הקנדית לחדשנות. א.ד. קיבל מלגה מארגון ארנדנד-פריייר.

Materials

Mice strain and stage  St. Constant, Quebec, Canada C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10X (stock) 1)      Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 
2)      Adjust the PH to 7.4 
3)      Add water to reach to the 1 litre final volume. 
TBS 10X (stock) 1)      Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 
2)      Adjust the PH to 7.5 
3)      Add water to reach to the 1 litre final volume. 
Name Company Catalog Number Comments
Part 1-Immunofluorescence
Freezing media VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada 95067-840 VMR frozen sections compound 
Microtome Mississauga, ON, Canada 956640 Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz
Blades C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada  BLM1001C High profile gold coated blades
Pap pen Cedarlane, Burlington, ON, Canada 8899 Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slides Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada 12-550-15 Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
Formaldehyde BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada FOR201.1 Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution 3% BSA in TBS
Wash solution TBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20 Oakville, ON, Canada P 9416 Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting media Cedarlane, Burlington, ON 17984-25(EM) Fluoromount-G
First & secondary antibodies  Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in Column D E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in Column D Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies  Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada  Mentioned in Column D β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in Column D Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stain Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada D1306 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS
Fluorescent microscope Nikon Canada, Mississauga, On, Canada Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysis Nikon Canada, Mississauga, On, Canada NIS-elements software (version 4)
Name Company Catalog Number Comments
Part 2-Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0  1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 
2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml).
3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. 
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitor Fisher Scientific, Burlington, ON 78441 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X)
Protein dosage Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA 23225 Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinder Fisher Scientific, Burlington, ON FTH-115 Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and stand Millipore, Etobicoke, ON, Canada PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IP PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in coulmn D IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in coulmn D IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl 
Primary antibodies for immunoprecipitation Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada Mentioned in coulmn D Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl 
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA Mentioned in coulmn D E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl 
Laemmli buffer  BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada 1610747 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine  Fisher Scientific, Burlington, ON PB381-5 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris  Fisher Scientific, Burlington, ON BP152-1 1 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1610180 -5 TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water
Membranes BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer method BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704155 Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry Milk Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blots TBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody  (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366)  1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10ml) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada Mentioned in column D Claudin3  (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody  (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1705061  Clarity Western ECL Blotting Substrate 
Imaging blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1708280 ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada ImageLab 5.2 software 

References

  1. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
  2. Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
  3. Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
  4. El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
  5. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
  6. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
  7. Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
  8. Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
  9. Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
  10. Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
  11. Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
  12. Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
  13. Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
  14. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
  15. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
  16. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  17. Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
  18. Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
  19. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).
  22. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  23. Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).

Play Video

Cite This Article
Dianati, E., Plante, I. Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands. J. Vis. Exp. (123), e55772, doi:10.3791/55772 (2017).

View Video