تحليل التفاعلات البروتين البروتين والمشاركة في توطين بين مكونات الفجوة، ضيق، والمالطيون تقاطعات في الغدد الثديية الفئران
Summary
تقاطعات بين الخلايا هي متطلبات الغدة الثديية وظائف مرحلة محددة والتنمية. توفر هذه المخطوطة بروتوكول مفصل لدراسة التفاعلات البروتين البروتين (بي) والمشاركة في التعريب باستخدام الغدد الثديية الفئران. هذه التقنيات تسمح للتحقيق في ديناميات الارتباط الجسدي بين التقاطعات بين الخلايا في مراحل تنموية مختلفة.
Abstract
التفاعلات خلية خلية تلعب دورا محوريا في الحفاظ على سلامة الأنسجة والحاجز بين المقصورات المختلفة للغدة الثديية. يتم توفير هذه التفاعلات من قبل البروتينات الوصلي التي تشكل الروابط بين الخلايا المجاورة. ويمكن أن يؤدي سوء توصيف البروتين الوصلي وتقليل الروابط الجسدية مع الشركاء الملتزمين إلى فقدان الوظيفة، وبالتالي إلى اختلال وظيفي في الجهاز. وبالتالي، تحديد توطين البروتين والتفاعلات البروتين البروتين (بي) في الأنسجة الطبيعية والمرض ذات الصلة أمر ضروري لإيجاد أدلة جديدة وآليات تؤدي إلى تطور الأمراض أو تغييرات في الوضع التنموي. تقدم هذه المخطوطة طريقة من خطوتين لتقييم مؤشر أسعار المنتجين في الغدد الثديية الفئران. في القسم بروتوكول 1، يتم وصف طريقة لأداء المناعي المشترك (شارك إف) باستخدام الأجسام المضادة التي تثار ضد البروتينات ذات الفائدة، تليها الأجسام المضادة الثانوية المسمى مع فلوروكروميس. على الرغم من شارك في إف جميعويعود إلى مظاهرة من قرب من البروتينات، فإنه يجعل من الممكن لدراسة التفاعلات المادية. لذلك، يتم توفير بروتوكول مفصل لالمناعي المشترك (إب المشترك) في القسم بروتوكول 2. وتستخدم هذه الطريقة لتحديد التفاعلات المادية بين البروتينات، دون التأكد مما إذا كانت هذه التفاعلات مباشرة أو غير مباشرة. في السنوات القليلة الماضية، وقد أثبتت إف شارك وتقنيات الملكية الفكرية المشتركة أن مكونات معينة من تقاطعات بين الخلايا تشارك في توطين والتفاعل معا، وخلق العلاقات التي تعتمد على مرحلة وظيفية التي تختلف أثناء تطوير الغدة الثديية.
Introduction
نمو الغدة الثديية والتنمية يحدث أساسا بعد الولادة. هذا الجهاز يعيد باستمرار نفسه في جميع أنحاء الحياة الإنجابية للثدييات 1 . وتتكون ظهارة الغدة الثديية الكبار من الطبقة الداخلية من الخلايا الظهارية اللمعية وطبقة خارجية من الخلايا القاعدية، وتتكون أساسا من الخلايا الظهارية، وتحيط بها غشاء الطابق السفلي 2 . لمراجعة جيدة على بنية الغدة الثديية والتنمية، يمكن للقارئ الرجوع إلى سترنليشت 1 . خلية الخلايا التفاعلات عبر الفجوة (غ)، ضيق (تي)، و تلتصق (آج) تقاطعات ضرورية للتطور الطبيعي وظيفة الغدة 1 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . المكونات الرئيسية لهذه التقاطعات في الغدة الثديية الفئران هي Cx26، Cx30، Cx32، و Cx43 (غ). كلودين -1، -3، -4، و -7 وزو-1 (تي)؛ و E-كادهيرين، P-كادهيرين، و β-كاتينين (آج) 7 ، 8 . مستويات التعبير عن هذه البروتينات متعددة وظيفية تختلف في طريقة تعتمد على مرحلة أثناء تطور الغدة الثديية، مما يشير إلى متطلبات التفاعل خلية خلية التفاضلية 9 . غ، تي، و آج ترتبط هيكليا ووظيفيا وحبل البروتينات الهيكلية أو التنظيمية الأخرى إلى المواقع المجاورة من الخلايا المجاورة، وبالتالي خلق علاقة الوصلية 10 . تكوين العلاقة الوصلية يمكن أن تؤثر على سد مع الهيكل الخلوي الكامنة، فضلا عن نفاذية العلاقة والاستقرار، ويمكن بالتالي تؤثر على وظيفة الغدة 8 ، 9 ، 10 ، 11 . مكونات تقاطعات بين الخلايا المقيمين في الوصلات الوصلي أو التفاعل مع بعضها البعض في ديفوقد تم تحليل مراحل النمو المتخلفة من تنمية الغدد الثديية مؤخرا باستخدام المناعي المشترك (شارك في إف) وشارك في مناعي (المشارك إب) 9 . في حين تسمح تقنيات أخرى لتقييم الارتباط الوظيفي بين البروتينات، لا يتم عرض هذه الأساليب في هذه المخطوطة.
كما البروتينات مجرد التصرف وحده للعمل، ودراسة التفاعلات البروتين البروتين (بي)، مثل نقل الإشارات والتسلسل الكيميائي الحيوي، أمر ضروري لكثير من الباحثين ويمكن أن توفر معلومات هامة عن وظيفة البروتينات. كو-إف والتحليل المجهري يساعد على تقييم عدد قليل من البروتينات التي تشترك في نفس الفضاء تحت الخلوية. ومع ذلك، فإن عدد الأهداف يقتصر على الأجسام المضادة، والتي يجب أن تثار في الحيوانات المختلفة، ومن خلال الوصول إلى المجهر متحد البؤر مجهزة ليزر مختلفة الطول الموجي وكاشف الطيفي لتعدد الإرسال. المشارك إب يؤكد أو يكشف التفاعلات المادية عالية تقارب بيتوإين اثنين أو أكثر من البروتينات المقيمين داخل مجمع البروتين. على الرغم من تطوير تقنيات جديدة، مثل مضان نقل الطاقة الرنين (الحنق) 12 وقرب ربط مقايسة (جيش التحرير الشعبى الصينى) 13 ، والتي يمكن أن تكتشف في وقت واحد توطين وتفاعلات البروتينات، إب المشترك يبقى تقنية مناسبة وبأسعار معقولة لدراسة التفاعلات بين البروتينات الذاتية.
طريقة خطوة بخطوة وصفها في هذه المخطوطة سيسهل دراسة توطين البروتين ومؤشرات الأداء القياسية، وتشير إلى المزالق لتجنب عند دراسة مؤشرات الأداء القياسية الذاتية في الغدد الثديية. تبدأ المنهجية مع عرض إجراءات المحافظة المختلفة للأنسجة المطلوبة لكل تقنية. الجزء 1 يعرض كيفية دراسة البروتين المشارك في توطين في ثلاث خطوات: ط) سيكتيونينغ من الغدد الثديية، إي) وضع علامات مزدوجة أو ثلاثية من البروتينات المختلفة باستخدام تقنية شارك في إف، و 3) التصوير منتوطين البروتين. الجزء 2 يبين كيفية ترسب البروتين الذاتية وتحديد البروتينات المتفاعلة في ثلاث خطوات: ط) إعداد المحللة، إي) غير مباشر مناعي البروتين، و 3) تحديد شريك ملزم من قبل سدز-بادج وغش لطخة الغربية. كل خطوة من هذا البروتوكول هو الأمثل للأنسجة الغدة الثديية القوارض ويولد ذات جودة عالية، محددة، وقابلة للتكرار النتائج. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول كنقطة انطلاق لدراسات مؤشر أسعار المنتجين في الأنسجة الأخرى أو خطوط الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
خلية الخلايا التفاعلات عن طريق تقاطعات مطلوبة للوظيفة المناسبة وتطوير العديد من الأجهزة، مثل الغدة الثديية. وقد أظهرت الدراسات أن البروتينات الوصفي يمكن أن تنظم وظيفة واستقرار بعضها البعض وتفعيل تنبيغ الإشارة عن طريق الربط بعضها البعض في غشاء الخلية 10…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل إب من قبل مجلس العلوم الطبيعية والهندسة البحوث في كندا منحة (نسيرك # 418233-2012)؛ (فروز دي ريشيرتش دو كيبيك-Santé (فروس)، وهي جائزة مهنية لمؤسسة سرطان الثدي في كيبيك، ومنحة ليدر فونز من منحة المؤسسة الكندية للابتكار. حصل إد على منحة دراسية من مؤسسة ونيفرزيتير أرماند-فرابير.
Materials
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10X (stock) | 1) Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.4 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
||
| TBS 10X (stock) | 1) Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.5 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 1-Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | Mentioned in Column D | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2-Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0 | 1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | Mentioned in coulmn D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
- Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
- Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
- Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
- Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
- Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
- Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
- Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
- Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
- Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
- Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
- Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
- Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).
