Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate<em> Tribolium castaneum</em> embrioni

Il rosso di farina coleottero Tribolium castaneum, che appartiene alla grande famiglia dei coleotteri Darkling (Tenebrionidae), ha una lunga storia all'interno delle scienze agricole e la vita ed è il modello modello di insetto organismo secondo miglior studiata dopo la mosca della frutta Drosophila melanogaster. Nel corso degli ultimi quattro decenni, è diventato un potente e popolare organismo modello di insetti in genetica dello sviluppo, nella biologia evolutiva dello sviluppo e, nel corso degli ultimi venti anni, nella morfogenesi embrionale per una serie di motivi:

Drosophila e Tribolium entrambi appartengono alla Holometabola, ma divergevano circa 300 milioni di anni fa ^{1, 2, 3, 4.} Mentre lo sviluppo embrionale di Drosophila è comunemente considerato come altamente derivato, Tribolium mostra una modalità più ancestrale di sviluppo che si trova in una proporzione considerevolmente più grande di specie di insetti ^{5, 6, 7, 8, 9.} In primo luogo, Tribolium presenta sviluppo testa non involuta, cioè le sue boccale e antenne emergono già durante l'embriogenesi ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} In secondo luogo, Tribolium segue i principi di sviluppo corto germe, cioè segmenti addominali vengono aggiunti in sequenza da una zona di crescita posteriore durante germband allungamento ^{16, 17, 18, 19.} In terzo luogo, Tribolium sviluppa e degrada successivedue membrane extra-embrionali cioè l'amnion, che copre l'embrione unico ventrale, e sierose, che avvolge completamente l'embrione ^{20, 21, 22.} Entrambe le membrane giocano un morfogenetica fondamentale ²³ nonché ruolo protettivo contro i microrganismi ^{24, 25} e ²⁶ essiccazione. In quarto luogo, le gambe embrione di sviluppo sono completamente funzionali durante la fase di vita larvale e servono come primordi per le gambe adulti durante la metamorfosi pupa ^{27, 28, 29, 30, 31.}

A causa delle loro dimensioni e modeste esigenze di piccole dimensioni, la coltivazione del Tribolium in laboratorio è abbastanza semplice. Le colture di wild-type (WT) ceppi o linee transgeniche consistono tipicamente di circa 100-300 adulti e può essere mantenuto entro bottiglie da un litro in vetro (impronta 80 cm ²⁾ riempito tre quattro centimetri alta (circa 50 g) con terreno di coltura costituito da frumento pieno fiore farina integrato con lievito secco attivo. Una fornitura di acqua non è necessaria. Questo permette anche piccoli laboratori di mantenere decine di culture beetle all'interno incubatori insetti disponibili commercialmente piccole o medie dimensioni. Successive fasi di sviluppo di larve Tribolium (dopo circa il quarto instar, pupe e adulti) sono facilmente separati dal mezzo di crescita mediante setacciatura. embrioni sincronizzati sono ottenuti incubando adulti per brevi periodi a medio deposizione delle uova. Per un rapido sviluppo, culture coleotteri sono mantenuti a 32 ° C (circa quattro settimane per generazione), mentre del magazzino viene tipicamente eseguita a 22-25 ° C (circa dieci settimane per generazione).

Negli ultimi dieci anni, molti tec di seriehniques sono stati gradualmente adattati e ottimizzati per Tribolium, come riassunto nei libri emergenti organismi modello ^32. Di grande importanza sono avanzati metodi genetici come embrionale ^33, larvale ^{34, 35} o parentale ^{36, 37} RNA interferenza basati silenziamento genico, trasformazione linea germinale sia con il piggyBac ^{38, 39} o il sistema trasposasi Minos ⁴⁰ e CRISPR / genoma Cas9 basata ingegneria ^41. Inoltre, il genoma è stato sequenziato Tribolium circa un decennio fa ^42, ed è ora nel terzo turno di genoma gruppo di rilascio ^43, che consente l'identificazione efficiente e genoma-larga e analisi sistematica dei geni ⁴⁴ </sup> o altri elementi genetici ^{45, 46.} Inoltre, i genomi di altre quattro specie di coleotteri sono disponibili per approcci genetici comparativi ^{47, 48, 49, 50.} In associazione con il genoma sequenziato, due analisi genetiche su larga scala sono state eseguite, ossia uno schermo mutagenesi inserzionale ⁵¹ e uno schermo silenziamento genico basato RNA interferenza sistematica ^{52, 53.}

Fluorescenza di imaging in tempo reale con widefield, confocale o la microscopia foglio a base di luce (LSFM) permette di osservare la morfologia embrionale di Tribolium in funzione del tempo (cioè la morfogenesi) in un contesto multidimensionale (Tabella 1). In widefield e confocale microscopia a fluorescenza, la excitzione e emissione di luce viene guidato attraverso la stessa lente obiettivo. In entrambi gli approcci, l'intero campione viene illuminato per ogni piano bidimensionale registrata. Quindi, i campioni vengono sottoposti a livelli energetici molto elevati. In LSFM, solo i fluorofori nel piano focale sono eccitati a causa di un disaccoppiamento di illuminazione e rilevazione utilizzando due lenti obiettivo perpendicolarmente disposti (figura 1). LSFM disponibile in due implementazioni canonici – il piano unico illuminazione microscopio (SPIM) e la luce laser digitalizzata foglio basata microscopio a fluorescenza digitale (DSLM, Figura 2) – e offre diversi vantaggi importanti rispetto agli approcci tradizionali: (i) capacità sezionamento ottico intrinseco, (ii) risoluzione buona assiale, (iii) fortemente ridotto livello di fotometabolismo, (iv) basso fototossicità, (v) alto rapporto segnale-rumore, (vi) relativamente elevata velocità di acquisizione, (vii) l'imaging lungo molteplici direzioni e (viii) la penetrazione nei tessuti più profondi grazie all'utilizzo di bassa apertura numerica illuminazione lenti obiettivo ^{54, 55, 56.}

LSFM è già stato applicato con successo in Tribolium per documentare quasi tutta la morfogenesi embrionale ⁵⁷ e di analizzare i principi di rottura della membrana extra-embrionali, all'inizio della chiusura dorsale ^23. Per aumentare l'attrattiva del LSFM nella comunità Tribolium e per la scienza degli insetti in generale, è di grande importanza per stabilire procedure operative standard e per migliorare i metodi, protocolli e il pool di risorse ad un livello in cui il microscopio diventa una facilità d' -utilizzare strumento standard nei laboratori di biologia dello sviluppo, e le questioni biologiche rimangono al centro dell'attenzione.

Questo protocollo inizia con le basi del Tribolium </ em> coltivazione, cioè la manutenzione, la riproduzione e la raccolta degli embrioni. Successivamente, due strategie sperimentali sono illustrati: (i) l'imaging dal vivo di linee transgeniche misura e (ii) l'imaging di embrioni fissi che sono state colorate con coloranti fluorescenti (Tabella 2). Successivamente, tre tecniche di fissaggio con scopi leggermente diversi sono spiegati in dettaglio (Figura 3 e Tabella 3): (i) la colonna agarosio, (ii) l'emisfero agarosio e (iii) il titolare ragnatela romanzo. Il protocollo spiega poi la procedura di acquisizione dati con LSFM. modalità di imaging e considerazioni chiave sono delineati. Infine, il recupero degli embrioni è spiegato e sono forniti suggerimenti per l'elaborazione dei dati di base. Nei risultati rappresentativi, dati di immagini in diretta da due nuovi su misura e le ⁵⁸ linee transgeniche Glia-blu sono mostrate e rispettivi set di dati di imaging sono forniti come una risorsa scaricabile. Inoltre, l'immagineDati di embrioni fisse che sono state colorate con una varietà di coloranti fluorescenti sono presentati. La discussione si concentra sul controllo della qualità, le attuali limitazioni dell'approccio di imaging dal vivo e l'adattamento del protocollo ad altre specie.

Il protocollo è scritto per microscopi a fluorescenza foglio a base di luce che sono dotati di una camera di campione e un meccanismo di serraggio girevole per i possessori standardizzati campione ^{54, 59, 60,} che sono tipicamente elementi a forma di cilindro di metallo, plastica o vetro con un diametro nella gamma di millimetro. Il protocollo è adatto anche per entrambe le implementazioni canoniche, cioè SPIM e DSLM, nonché per configurazioni con due o più bracci di illuminazione e di rilevamento ^{61, 62, 63.} I risultati rappresentativi mostrano dati in due canali spettrali, verde (illumination con un laser 488 nm, rilevamento attraverso un filtro passabanda 525/50) e rosso (illuminazione con un laser 561 nm, rilevamento attraverso un filtro passabanda 607/70), ma il protocollo può essere esteso a tre o quattro canali spettrali.