גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em> Tribolium castaneum</em> עובר

חיפושית קמח אדום Tribolium castaneum, אשר שייך למש' הגדולה של חיפושיות אפלוליות (Tenebrionidae), יש היסטוריה ארוכה בתחום מדעי החקלאות וחיים והוא האורגניזם השני הכי טוב לומד מודל חרקי המודל אחרי זבוב הפרות תסיסנית. במהלך ארבעת העשורים האחרונים, זה הפך אורגניזם מודל החרק חזק ופופולרי בגנטיקה התפתחותית, בביולוגיה התפתחותית אבולוציונית, במהלך עשרים השנים האחרונות, ב morphogenesis העוברי עבור מגוון רחב של סיבות:

תסיסנית Tribolium שניהם שייכים Holometabola, אך נפרדו כ -300 מיליון שנים לפני ^{1, 2, 3, 4.} בעוד ההתפתחות העוברית של תסיסנית נחשבה בכינויו נגזר מאוד, Tribolium מציגה מצב אבות יותר של development שנמצא שיעור גבוה יותר משמעותית של מיני חרקים ^{5, 6, 7, 8, 9.} ראשית, Tribolium מציג פיתוח הראש הלא involuted, כלומר איברי הפה המחושים שלה לצוץ כבר במהלך העובר ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} שנית, Tribolium מלווה את העקרונות של פיתוח קצר נבט, כלומר קטעי בטן מתווספים ברצף מאזור הגידול האחורי במהלך התארכות germband ^{16, 17, 18, 19.} שלישית, Tribolium מפתחת מדרדרת מאוחרשתי ממברנות חוץ עוברי כלומר את amnion, אשר מכסה את העובר רק ventrally, ואת serosa, שעוטף את העובר לחלוטין ^{20, 21, 22.} ממברנות שניהם ממלאים המוךפו"גנטי שהולך מכריע ²³ כמו גם תפקיד המגן נגד מיקרואורגניזמים ^{24, 25} ו ²⁶ התייבשות. רביעית, הרגליים מתפתחות בעוברים פועלים באופן תקין לחלוטין בשלב בחיים הזחל לשמש primordia עבור הרגליים הבוגרת במהלך המטמורפוזה גלמי ^{27, 28, 29, 30, 31.}

בשל דרישות הגודל צנוע הקטנות שלהם, טיפוח Tribolium במעבדה הוא פשוט למדי. תרבויות של wild-type (WT) זנים או קווי מהונדס מכילים בדרך כלל סביב 100-300 מבוגרים יכולים להישמר בתוך בקבוקי זכוכית חד ליטר (טביעת 80 ס"מ ²⁾ מילא שלושה כדי בארבעה סנטימטרים גבוה (כ 50 גרם) עם מדיום הגידול הכולל של חיטה דגנים מלאים קמח בתוספת שמרים יבשים פעילים. צינור לאספקת מים אין צורך. זה מאפשר גם מעבדות קטנות כדי לשמור על עשרות תרבויות חיפושית בתוך אינקובטורים חרקים קטנים או בינוניים זמינים מסחרית. בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר Tribolium (זחלים אחרי בערך instar הרביעיים, גלמים ומבוגרים) מופרדים בקלות מן מדיום הגידול ידי סינון. עובר מסונכרן מתקבלים על ידי דוגרי מבוגרים לתקופות קצרות על מדיום הטלה. עבור פיתוח מהיר, תרבויות חיפושית נשמרות 32 ° C (כארבעה שבועות לכל דור), תוך שמירה על מניות מבוצעת בדרך כלל ב- C ° 22-25 (כעשרה שבועות לכל דור).

במשך העשור האחרון, tec סטנדרטי רבhniques הותאמו בהדרגה אופטימיזציה עבור Tribolium, כפי שמסוכם הספרים אורגניזמים מודל Emerging ^32. חשיבות רבה הם מתקדמים בשיטות גנטיות כגון ³³ עובריים, ^{34 זחל, 35} או ^{36 הורית, 37} RNA מציאת גן מבוסס הפרעה, טרנספורמציה germline גם עם ^{38 piggyBac, 39} או מערכת מינוס ⁴⁰ transposase ו קריספר / בגנום מבוסס Cas9 הנדסה ^41. יתר על כן, הגנום Tribolium כבר רצף לפני כעשור ^42, והיום הוא בסיבוב השלישי של הגנום הרכבה לשחרר ^43, אשר מאפשר זיהוי יעיל הגנום כולו וניתוח שיטתי של גנים ⁴⁴ </sעד> או אלמנטים גנטיים אחרים ^{45, 46.} בנוסף, את הגנומים של ארבעה מינים קשים כנפיים התפוצצו בפניו אחרים זמינים עבור גישות גנטיות השוואתיות ^{47, 48, 49, 50.} בשיתוף עם הגנום הרצף, שני ניתוחים גנטיים גדולים בוצעו, כלומר מסך mutagenesis insertional ⁵¹ ו RNA השיטתית הפרעה מבוססת מציאת גן מסך ^{52, 53.}

דימות פלואורסצנטי חיה עם widefield, confocal או מיקרוסקופ מבוסס גיליון אור (LSFM) מאפשרת לבחון את המורפולוגיה העוברית של Tribolium כפונקציה של זמן (כלומר morphogenesis) בהקשר רב-ממדים (לוח 1). בשנת widefield הקרינה confocal מיקרוסקופ, את Excitאור ation והפליטה מונחה דרך העדשה האובייקטיבית. בשתי הגישות, הדגימה כולו מוארת לכל מטוס דו ממדי רשם. לפיכך, הדגימות חשופות לרמות אנרגיה גבוהות מאוד. בשנת LSFM, רק fluorophores במישור המוקד נרגש בשל ביטול צימוד של תאורה וזיהוי באמצעות שתי עדשות אובייקטיביות סודר בניצב (איור 1). LSFM מגיע בשני מימושים הקאנוני – למיקרוסקופ תאורת המטוס הבודד (SPIM) ואור הליזר הדיגיטלי סרוק מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס הגיליון (DSLM, איור 2) – ומציע מספר יתרונות מכריעים על פני גישות מסורתיות: (i) יכולת חתך אופטית פנימית, (ii) רזולוציה צירית טוב, (iii) ברמה מופחתת מאוד של הלבנת צילום, (iv) צילום רעילות נמוכה מאוד, (נ) יחס אות לרעש גבוה, (vi) מהירות רכישה גבוהה יחסית, (vii) הדמיה לאורך כיוונים מרובים (viii) חדיר לרקמות עמוקות יותר בשל השימוש של עדשות אובייקטיביות תאורת מספרי צמצם נמוכה ^{54, 55, 56.}

LSFM כבר יושם בהצלחת Tribolium לתעד כמעט המורפוגנזה העוברי כולו ⁵⁷ ו לנתח את העקרונות של קרע קרום חוץ עוברי בתחילת גב סגר ^23. כדי להעלות את האטרקטיביות של LSFM בקהילת Tribolium ועבור מדע חרקים בכלל, זה הוא בעל חשיבות רבה להקמת נהלי עבודה ועל מנת לשפר את השיטות, פרוטוקולים בברכה של משאבים לרמה שבה מיקרוסקופ הופך קל -השתמש כלי סטנדרטי במעבדות הביולוגיה ההתפתחותית, ואת השאלות ביולוגי להישאר במרכז תשומת הלב.

פרוטוקול זה מתחיל עם יסודות של Tribolium </ em> טיפוח, תחזוקה כלומר, רבייה ואיסוף עובר. הבא, שתי אסטרטגיות ניסיוני מומחשות: (i) הדמית חיה של קווים מהונדסים מחוייט (ii) הדמיה של עוברים קבועים כי הוכתמו צבעי ניאון (לוח 2). כתוצאה מכך, שלוש טכניקות הרכבה עם מטרות שונות מעט מוסברים בפירוט (איור 3 ולוח 3): (i) בעמודה agarose, (ii) בחצי הכדור agarose ו (iii) בעל קורי עכביש הרומן. הפרוטוקול ואז מסביר את הליך רכישת נתונים עם LSFM. שיטות הדמיה ושיקולים מרכזיים מתוארות. לבסוף, חזר עובר מוסבר והצעות לעיבוד נתונים בסיסיים מסופקות. בתוצאות הנציג, נתוני הדמיה חיים משני רומן מחוייט הקווים המהונדסים ^{58-כחולת} גליה מוצגים ואת מערכי נתוני הדמית בהתאמה ניתנים כמשאב להורדה. בנוסף, תמונהנתונים של עוברים קבועים כי הוכתמו במגוון צבעי קרינה מוצגים. הדיון מתמקד בקרת איכות, מגבלות נוכחיות של גישת ההדמיה חי ואת ההסתגלות של פרוטוקול מינים אחרים.

הפרוטוקול נכתב עבור מיקרוסקופים פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון המצוידות בתא מדגם מנגנון מהדק rotatable עבור מחזיקי מדגם סטנדרטיים ^{54, 59, 60,} שהן בדרך כלל אלמנטים בצורת גליל עשויים מתכת, פלסטיק או זכוכית בקוטר בטווח המילימטר. הפרוטוקול מתאים גם הוא מימושים הקאנוני, כלומר SPIM ו DSLM, כמו גם עבור setups עם לפחות שתי זרועות תאורה וזיהוי ^{61, 62, 63.} התוצאות נציג להראות נתונים בשני ערוצי ספקטרלי, ירוק (illumination עם לייזר 488 ננומטר, זיהוי באמצעות 525/50 bandpass מסנן) ואדום (תאורה עם לייזר 561 ננומטר, זיהוי באמצעות 607/70 bandpass מסנן), אבל הפרוטוקול ניתן להרחיב לערוצים ספקטרלי שלוש או ארבע.