CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개
Summary
형광 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 겔 전기 영동, 모세관에 결합 여기에 설명 된 기술 유전자형은 뉴 클레아 제 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 유전자형을 허용한다. 그것은 다른 유전자형 기술에 의해 직면 한 한계를 우회하고 시퀀싱 방법보다 더 비용 효과적입니다.
Abstract
프로그램 게놈 편집 도구의 개발은 특정 게놈 서열이 세포 전체 유기체의 기능에서하는 역할을 이해하는 역 유전학의 사용을 촉진했다. 이 원인은 엄청나게 CRISPR의 최근 도입 연구자하기 위해, 다른 것들 중, 게놈과 전 사체를 조작 노크, 노크, 또는 표적 유전자에 노크 할 수 있습니다 / Cas9 시스템 – 다용도 도구의 도움되었습니다 방법. 유전자를 녹아웃의 목적을 위해, CRISPR / 이중 가닥 나누기 휴식 사이트에서 뉴클레오티드의 틀 이동을 유발하는 삽입 또는 삭제를 소개하는 비 동종 최종 합류 DNA 수리 경로를 모집 Cas9는 매개. 그러나, 개별 가이드 RNA가 바람직하지 않은 오프 대상 영향을 일으킬 수 있으며, 이들을 배제하기 위해, 여러 가이드의 RNA의 사용이 필요하다. 대상이 또한 다수의 클론 대량 선별이 교대 EF에서의 사용을 돌려서, 이는 요구되는 것을 의미녹아웃 클론 유전자형 높은 처리량 기술을 ficient. 현재 유전자형 기술 중 하나는 따라서 높은 처리량을 위해 적합하지 않다 렌더링, 본질적인 한계로 고통 또는 높은 비용이 발생. 여기서, 주형으로 조 세포 용 해물로부터 게놈 DNA를 사용하여 형광 PCR을 사용하고, 모세관 젤 전기 영동을 통해 PCR 단편을 해결하기위한 우리 상세히 프로토콜. 이 기법은 하나의 단편 간의 염기쌍의 차이를 구별하기에 충분히 정확하고, 따라서 표적 유전자의 코딩 서열의 프레임 이동의 유무를 나타내는에 적합하다. 이 정확한 지식을 효과적으로 확증 시퀀싱 단계의 필요성을 배제하고 사용자가 그 과정에서 시간과 비용을 절약 할 수 있습니다. 여기에 다른 곳에서와 같이 또한,이 기술은 다수의 유전자에 대한 가이드 RNA를 표적 다양한 조직 기원의 다양한 포유 동물 세포 유전형에 다양한 것으로 입증되었습니다.
Introduction
역방향 유전 방식은 과학자들이 셀 또는 전체 유기체의 게놈의 특정 변경의 효과를 규명 할 수있다. 예를 들어, 특정 유전자의 발현이 세포의 또는의 기능을 갖는다는 효과를 확인하기 위해 유전자 녹다운 (1, 2) (부분 감소) 또는 유전자 녹아웃 (3), 4 (완전 제거)에 의해 감쇠 될 수있다 유기체의 개발.
유전자 녹아웃 (knockout) 실험은 징크 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성화 제와 같은 이펙터 클레아 (TALENs)와 같은 특정 프로그램 시퀀스 클레아의 도입 이후 쉽게되고있다. 그러나 정기적으로 짧은 회문 반복 (CRISPR)을 산재 클러스터 된의 상대적으로 최근의 특성화 / Cas9 시스템은 세대를 수행 할 수있는 전 세계 모든 실험실은 매우 간단했다전자 녹아웃 실험. 본질적으로, CRISPR / Cas9 시스템은 두 개의 필수 성분-A 인식 및 게놈의 특정 염기 서열에 상보성 단일 결합을 통해 가이드 RNA (sgRNA) 및 Cas9라고하는 효소로 구성된다. 게놈 DNA의 sgRNA-Cas9 복합체의 특이 적 결합 및 동작의 여파는 DNA의 이중 가닥을 절단한다. 이는 다시, 계속해서 비 – 상동 최종 접합 (NHEJ) 또는 동종 재조합 (HR) 경로를 통해 복구 된 세포에서 DNA 손상 반응 메커니즘을 트리거한다. NHEJ 수리 메커니즘 (그러나 HR 메커니즘이) 자주 삽입 / 삭제 (INDEL) 돌연변이의 결과로, 수리의 사이트에서 무작위로 삽입 또는 뉴클레오티드의 삭제를 초래하기 때문에, 엑손의 독서 프레임이 이동 될 수 있습니다. 이 다음에 의한 번역 및 넌센스 매개 붕괴 5, 6의 조기 종료에 유전자의 녹아웃 될 수 있습니다7.
유전자를 노크의 CRISPR / Cas9 시스템의 도입에 의해 제공되는 편리함에도 불구하고, 표적 세포의 클론의 유전자형은 특히 8, 9를 설정하는 높은 처리량, 병목 남아있다. 주요 본질적인 한계로 고통 또는 재정적 비용이 많이 드는 중 기존 기술. 예를 들어, 10 이중 가닥 DNA에서 불일치를 검출하는 효소 분석이다 검사원 또는 T7E1 분석은 야생형 클론 및 동형 접합성 돌연변이를 구별 할 수없는 이들 클론은 동일한 대립 유전자를 가지고 있고, 따라서 이후 (그 대립 동일 돌연변이 클론) 이들 DNA 서열 11 불일치를 표시하지 않는다. 또한, 높은 처리량 설정에서, 돌연변이 클론 유전형의 황금 표준으로 간주됩니다 생거 시퀀싱의 사용으로 인해 높은 비용 바람직하지 않다. 여기, 우리는 DET을 제시다른 유전자형 기존 기술의 한계를 회피하고 클레아 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 스크린을 수행하는데 특히 유용 할 수있는 형광 PCR 모세관 전기 영동 기술의 ailed 프로토콜. 이 방법을 수행 할 기술적으로 간단하고 시간과 비용을 절약 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
선택의 모델 세포주에서 특정 유전자에서 노크는 유전자가 특정 세포 맥락에서하는 역할을 해명하기위한 일상이되었다. 사실, 여러 게놈 넓은 화면은 게놈 14, 15, 16에 거의 알려진 모든 인간의 유전자를 대상으로 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하는 현재 사용할 수 있습니다. 이러한 대규모의 화면 (또는 관심의 개별 유전자의 대상?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 모세관 전기 영동 실험을 도와 양 탄시 민, 미스 헬렌 옹, 박사 자오 이순신에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 / 2,011분의 1,314 NMRC 및 환경부 AcRF 계층이 기금 보조금 MOE2011-T2-1-051을 부여 NMRC / IRG에 의해 지원되었다.
Materials
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
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