Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput
Summary
La tecnica qui descritta genotipizzazione, che accoppia fluorescente reazione a catena della polimerasi (PCR) per elettroforesi su gel capillare, permette high-throughput genotipizzazione di cloni knockout nucleasi-mediata. Elude limitazioni incontrate da altre tecniche di genotipizzazione ed è più conveniente rispetto ai metodi di sequenziamento.
Abstract
Lo sviluppo di strumenti genoma di modifica programmabili ha facilitato l'uso di genetica inversa per comprendere i ruoli specifici sequenze genomiche giocano nel funzionamento delle cellule ed organismi interi. Questa causa è stata enormemente aiutato dalla recente introduzione del CRISPR / sistema-a Cas9 strumento versatile che permette ai ricercatori di manipolare il genoma e trascrittoma al fine di, tra le altre cose, knock out, abbattere, o bussano nei geni in modo mirato maniera. Allo scopo di mettere fuori un gene, CRISPR / Cas9-mediata rotture a doppio filamento reclutano fine-joining non omologhe riparazione del DNA percorso per introdurre l'inserimento frameshift causano o delezione di nucleotidi nel sito rottura. Tuttavia, un individuo RNA guida può causare indesiderati effetti off-target e per escludere questi fuori, l'uso di più RNAs guida è necessario. Questa molteplicità di bersagli significa anche che è richiesto uno screening ad alto volume di cloni, che a sua volta pone l'uso di un efciente tecnica high-throughput al genotipo i cloni eliminazione diretta. tecniche di genotipizzazione correnti sia soffrono di limitazioni intrinseche o comportano costi elevati, quindi rendendoli inadatti per alte produttività. Qui, si dettaglio il protocollo per l'utilizzo fluorescente PCR, che utilizza il DNA genomico da lisato cellulare grezzo come modello, e quindi risolvere i frammenti di PCR mediante gel elettroforesi capillare. Questa tecnica è abbastanza accurata per differenziare differenza una base-pair tra frammenti e quindi è adeguata indicante la presenza o l'assenza di un frameshift nella sequenza codificante del gene bersaglio. Questa conoscenza precisa preclude efficacemente la necessità di una fase di sequenziamento di conferma e permette agli utenti di risparmiare tempo e costi nel processo. Inoltre, questa tecnica ha dimostrato di essere versatile genotipizzazione varie cellule di mammifero di varia origine tessuto mirato da RNA guida contro numerosi geni, come mostrato qui e altrove.
Introduction
approcci di genetica inversa hanno permesso agli scienziati per chiarire gli effetti delle alterazioni specifiche nel genoma sulla cella o tutto l'organismo. Ad esempio, l'espressione di un particolare gene può essere attenuato di silenziamento genico 1, 2 (riduzione parziale) o gene knockout 3, 4 (ablazione completa) al fine di determinare l'effetto che questo ha sulla funzione della cella o sulla sviluppo dell'organismo.
Esperimenti gene knockout sono più facili dall'introduzione della nucleasi programmabili sequenza-specifiche, quali nucleasi zinco-dito (ZFNs) e trascrizione attivatore simile nucleasi effettrici (Talens). Tuttavia, la relativamente recente caratterizzazione del cluster intervallati regolarmente breve ripetizione palindromo (CRISPR) / Sistema Cas9 ha reso estremamente facile per qualsiasi laboratorio in tutto il mondo per eseguire genesperimenti knockout e. In sostanza, il sistema / Cas9 CRISPR costituito da due componenti essenziali: un singolo guida RNA (sgRNA), che riconosce e si lega con la complementarità di base ad una sequenza specifica nel genoma, e un'endonucleasi chiamato Cas9. Le conseguenze della specifica azione vincolante e del complesso sgRNA-Cas9 su DNA genomico è la scissione doppio filamento del DNA. Questo, a sua volta, fa scattare il meccanismo di risposta al danno del DNA nella cellula, che viene successivamente riparato attraverso le vie non omologhi end-giunzione (NHEJ) o ricombinazione omologa (HR). Poiché il meccanismo NHEJ riparazione (ma non il meccanismo HR) comporta spesso l'inserimento o delezione di nucleotidi casuali nel sito di riparazione, con conseguente inserimento / delezione (INDEL) mutazioni, può causare la griglia di lettura di un esone spostare. Questo può quindi provocare il knockout del gene dovuto premature terminazione della traduzione e decadimento mediato da un nonsenso 5, 6,7.
Nonostante la comodità offerta dalla introduzione del sistema di CRISPR / Cas9 in buttare giù un gene, la genotipizzazione dei cloni di cellule bersaglio resta un collo di bottiglia, soprattutto in un ambiente 8, 9 high-throughput. tecniche esistenti o soffrono principali limitazioni intrinseche o sono finanziariamente costoso. Ad esempio, il saggio SURVEYOR o T7E1, che è un saggio enzimatico che rileva disallineamenti di DNA duplex 10, non è in grado di distinguere tra cloni di tipo selvatico e mutanti omozigoti (cloni cui alleli sono mutati identico), poiché questi cloni hanno alleli identici e pertanto non presentano disallineamenti nella loro sequenza di DNA 11. Inoltre, l'uso di Sanger sequenziamento, che è considerato il gold standard nella genotipizzazione cloni mutanti, in una configurazione ad alta produttività è indesiderabile a causa della sua costo elevato. Qui, vi presentiamo una detprotocollo soffriva esattamente della tecnica gel elettroforesi capillare PCR-fluorescente, che può aggirare le limitazioni delle altre tecniche di genotipizzazione esistenti ed è particolarmente utile nell'esecuzione di uno schermo ad elevata capacità di cloni knockout nucleasi-mediata. Questo metodo è tecnicamente semplice da eseguire e consente di risparmiare tempo e costi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il bussare fuori di un gene specifico in una linea cellulare modello di scelta è diventata routine per chiarire il ruolo che il gene gioca in quel particolare contesto cellulare. Infatti, più schermate genoma sono attualmente disponibili che utilizzano il sistema CRISPR / Cas9 target virtualmente tutti noti geni umani nel genoma 14, 15, 16. Con questi schermi di grandi dimensioni (o anche su piccola scala mira dei singoli gen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare la signora Tan Shi Min, la signora Helen Ong, e il dottor Zhao Yi per aiutare con gli esperimenti di elettroforesi capillare gel. Questo lavoro è stato sostenuto da NMRC / IRG concedere NMRC / 1314/2011 e MOE ACRF Tier 2 Fondo concessione MOE2011-T2-1-051.
Materials
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
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