Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

abordagens de genética reversa permitiram aos cientistas elucidar os efeitos de alterações específicas no genoma da célula ou organismo todo. Por exemplo, a expressão de um gene particular pode ser atenuado pelo gene knockdown ^{1, 2} (redução parcial) ou nocaute do gene ^{3, 4} (ablação completa), a fim de determinar o efeito que este possui sobre a função da célula ou sobre a desenvolvimento do organismo.

experimentos gene knockout tornaram-se mais fácil uma vez que a introdução de nucleases programáveis ​​específicas das sequências, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e de transcrição nucleases efectoras activadores-like (TALENS). No entanto, a caracterização relativamente recente da agrupado regularmente intercaladas curta repetição palíndromo (CRISPR) / sistema cas9 tornou extremamente fácil para qualquer laboratório em todo o mundo para realizar gene experimentos nocaute. Em essência, o sistema / cas9 CRISPR consiste de dois componentes de um único ARN essenciais guia (sgRNA), que reconhece e liga-se através da complementaridade de base para uma sequência específica no genoma, e uma endonuclease chamado cas9. As consequências da acção de ligação e específico do complexo sgRNA-cas9 no ADN genómico representa a clivagem de cadeia dupla de ADN. Este, por sua vez, acciona o mecanismo de resposta de dano de DNA na célula, a qual é subsequentemente reparadas através das vias (HR) de linha de junção (NHEJ) ou de recombinação homóloga não homólogas. Uma vez que o mecanismo de NHEJ de reparação (mas não o mecanismo de RH) muitas vezes resulta na inserção aleatória ou eliminação de nucleótidos no local de reparação, resultando na inserção / deleção (InDel) mutações, ele pode fazer com que o quadro de leitura de um exão de mudar. Isto pode resultar em seguida, o nocaute do gene devido à terminação prematura da tradução e deterioração mediado por mutações nonsense ^{5, 6,7.}

Apesar da conveniência proporcionada pela introdução do sistema / cas9 CRISPR em batendo para fora de um gene, a genotipagem de clones de células alvo permanece um gargalo, especialmente em um ajuste ^{8, 9} de alto rendimento. técnicas existentes tanto sofrem grandes limitações inerentes ou são financeiramente caro. Por exemplo, o ensaio inspector ou T7E1, que é um ensaio enzimático que detecta erros de emparelhamento em DNA duplexes ^10, não é capaz de distinguir entre os clones de tipo selvagem e mutantes homozigicos (clones cujos alelos s mutados de forma idêntica), uma vez que estes clones têm alelos idênticos e, portanto, não apresentam erros de emparelhamento na sua sequência de ADN ^11. Além disso, a utilização de sequenciação de Sanger, que é considerada o padrão de ouro na genotipagem de clones mutantes, em uma instalação de alto rendimento é indesejável devido ao seu elevado custo. Aqui, apresentamos um detailed protocolo da técnica de electroforese em gel de PCR-capilar fluorescente, que pode contornar as limitações das outras técnicas de genotipagem existentes e é particularmente útil na realização de um ecrã de alto rendimento de clones knockout mediada por nucleases. Este método é tecnicamente simples de executar e economiza tempo e custo.