Yeni Nesil Electroporasyonun tarafından İlköğretim İnsan Th17 Hücreleri Küçük RNA Transfeksiyon
Summary
Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.
Abstract
CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.
Introduction
CD4 + T hücreleri adaptif bağışıklık tepkisinin önemli Orkestraya bulunmaktadır. Naif CD4 + T hücreleri, birkaç farklı efektör T hücrelerinin (örneğin Th 1, Th2 Th17, vs.) halinde gelişme yetisine sahip olan, yerel mikro 1 bağlı olarak karakteristik bir sitokinler ve transkripsiyon faktörleri, kendi seti, her biri. T hücreleri yapmak soy kararları kendine hem koruyucu bağışıklığın ve hoşgörü için önemlidir. Th17 hücreleri hücre-dışı bakteriler ve mantarlar ile mücadele için bilinen T hücrelerinin bir alt kümesi, ancak bunların uygun olmayan tepkiler aynı zamanda, mültipl skleroz ve psoriasisin 2, 3 gibi çok otoimmün ve inflamatuar hastalıkların patogeneziyle edilir. İnsan Th17 hücreleri uygun bir polarizasyon çevre 4 sağlayarak, in vitro olarak naif CD4 + T hücrelerinden üretilebilir. Vario sitokinlerin bize kombinasyonları, IL-1β, IL-23, TGFp, ve IL-6, insan Th17 hücrelerinin gelişimi için kullanılmıştır. İnsan Th17 hücreleri CCR6 yaygın olarak bu hücre popülasyonu tespit etmek için kullanılır ve esas transkripsiyon faktörü (RORC tarafından kodlanan) RORγt 5, 6 ekspresyonu ile tanımlanır bir kemokin reseptörünü eksprese eder. Th17 hücreler birden fazla sitokinleri ifade etme yeteneğine sahiptir, ancak, IL-17A, bu hücreler tarafından üretilen soy tanımlayan efektör sitokindir. Biz, insan Th17 in vitro farklılaşma deneyinde sağlamlığını belirlemek için her üç Th17-ilişkili markörler (CCR6, RORγt IL-17A) ifadesini inceledi. Buna ek olarak, bu, Th17 markerlerin ekspresyonu çok düşük ya da sıfır olması gerektiği için hiçbir sitokinler ya da bloke edici antikorlar, bir negatif kontrol olarak kullanmak için, kültür ortamına ilave edildi olmayan polarizasyon koşulları altında, insan CD4 + T hücrelerinin kültive edilmiştir.
ve_content "> normal insan T hücresi gelişimini ve biyolojisi okumak için bir yolu, gelişimi esnasında gen ekspresyonunu değiştirmek için. Kısa müdahale RNA (siRNA) protein kodlayıcı mRNA'ları hedefleyebilir ve spesifik gen ekspresyonunu azaltmak için kullanılabilir sentetik küçük RNA molekülleridir . MikroRNA'lar (miRNA'lar) post-transkripsiyonel gen ekspresyonunu modüle etmek için bilinen bir endojen kodlayıcı olmayan küçük RNA'larıdır. miRNA'lann Th17 hücreleri 7, 8, 9, de dahil olmak üzere, murin ve insan T hücresi biyolojisi hem de önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Bu gen ifadesi ve nihayetinde insan T hücre biyolojisi üzerindeki etkilerini incelemek için insan T hücrelerinde küçük RNA aktivitesini manipüle güvenilir yöntemler olması çok önemlidir. Burada, biz tanıştırmak için geliştirilen bir, kullanımı kolay, tutarlı ve güvenilir protokol açıklar küçük sentetik RNA ve kilitli nükleik asitleri (LNA'lar, kimyasal stabilite artışı olan modifiye edilmiş nükleik asitleri)bağışıklık hücrelerine ve özellikle insan Th17 hücrelerine.Genel olarak, kimyasal, biyolojik veya fiziksel kategoriye 10 girer memeli hücrelerine dahil etmek küçük RNA'ların sokulması çeşitli alternatif yöntemler vardır. lipid bazlı transfeksiyonları ve kalsiyum fosfat transfeksiyonlar dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan kimyasal metotlar, daha etkili bir şekilde hücreler tarafından alınır kimyasal DNA kompleksleri temel almaktadır. Genel olarak, kimyasal yöntemler, birincil T hücrelerinin transfeksiyonu için etkili değildir. En yaygın biyolojik yöntem doğrudan doğal replikasyon döngüsünün bir parçası olarak bir konakçıya yabancı RNA ekler bir viral vektör (örneğin, retrovirüs veya lentivirüs) kullanmaktır. Viral transdüksiyon tipik olarak bir proviral plazmid moleküler klonlanması için zaman dahil edilen, özellikle tamamlamak için daha uzun sürer. Buna ek olarak, virüs transdüksiyon vektörleri, insan araştırmacılar için zararlı olabilir. Elektroporasyon fiziksel mNükleik asitler, geçici olarak kendi hedef üzerinde hareket edebilir hücre içine girmesine izin verir, yüksek voltaj darbeleri hücreleri tabi tutulması ile membran geçirgenliği indükleme bu yöntemde. Geleneksel elektroporasyon araçlar primer lenfositler transfekte etmek için etkili değildi. Bununla birlikte, optimum nesil elektroporasyon malzeme küçük RNA'dır Transfekte edilecek, özellikle de çok yüksek bir verimle, T hücrelerini transfekte edebilen olduğu kanıtlanmıştır. Terimi, yeni nesil gevşek geleneksel elektroporasyon makineleri ile iki yeni platformları (örneğin, neon, Amaxa) ayırt etmek için kullanılır. Buna ek olarak, bu yöntem tek bir deneyde yaklaşık 120 küçük RNA, kadar, genellikle geçerli sentetik reaktif maddeler kullanılarak orta derecede verimli taramalara kolayca ölçeklendirilebilir. Önemli olarak, başarılı bir şekilde transfeksiyon, T hücresi aktivasyonundan sonra az 16 olarak saat içinde elde edilebilir. Bu yöntemin dezavantajı, ancak stabil genomik incorporati neden olmamasıdırüzerinde ve dolayısıyla geçicidir. Bu nedenle, bu şekilde bir viral vektör içine paketlenmiş ve başarılı bir şekilde küçük bir RNA uzun süreli ekspresyonu gereken durumlarda T-hücrelerinde ifade edilebilir dengeli bir ifade yapısı oluşturmak için ilave çaba değerdir.
Farklı amaçlarla 11, 12, 13 için çeşitli sentetik tek veya çift-sarmallı RNA ya da LNA oligonükleotid araçlar sağlamak için, yeni nesil bir transfeksiyon (örneğin, neon) kullandık. Etkin RNA interferans çift sarmallı kısa karışan RNA (siRNA) kullanılarak primer fare ve insan T-hücrelerinde indüklenebilir. Bu protokol, insan Th17 hücrelerinde bu tekniği kullanarak için optimize koşulları açıklar. siRNA'lar ek olarak, ticari olarak temin edilebilen sentetik MiRNA taklit ve inhibitörler MiRNA kazanç ve fonksiyon kaybı incelemek için kullanılabilir. MiRNA taklit siRNA'lar çok benzer iki-şeritli RNA molekülü, ancak designeEndojen olgun miRNA'lann dizisi ile d. MiRNA inhibitörleri doğal miRNA'lara bağlanan ve fonksiyonunu antagonize RNA ve / veya LNA göre tek zincirli oligonükleotidler kimyasal olarak modifiye edilir. Biz bu araçların tümü dahil, kültürlü birincil T lenfositler etkin kullanılan ancak insan Th17 hücreleri ile sınırlı değildir edilebileceğini bulmuşlardır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, insan Th17 hücrelerine küçük RNA verilmesi için geliştirilmiş bir yöntemi temin etmektedir. İnsan Th17 hücreleri burada kullanılmış olsa da, küçük RNA ile elektroporasyon bu yöntem, Th1, Th2 ve Tregs gibi primer insan T yardımcı alt grupları, birlikte kullanılabilir. Hücreler transfeksiyondan önce kültür içinde etkinleştirilmiş olmalıdır böylece saf CD4 + T hücreleri için, iyi sonuçlar vermemiştir. Bu protokol için, ilk olarak daha iyi bir IL-17A üretimi için…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the US National Institutes of Health grants (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), a Leukemia & Lymphoma Society scholar award (K.M.A.), and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).
Materials
| anti-human IL-17A PE | ebioscience | 12-7179-42 | Clone: eBio64DEC17 |
| anti-human IFNg FITC | ebioscience | 11-7319-82 | Clone: 4S.B3 |
| anti-human CD4 eVolve605 | ebioscience | 83-0047-42 | Clone: SK3 |
| mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 | BD biosciences | 562515 | Clone: 11A9 |
| anti-human RORgt AF647 | BD biosciences | 563620 | Clone: Q21-559 |
| anti-human CD45 eFluor450 | ebioscience | 48-9459-42 | Clone: 2D1 |
| Foxp3/Trascription Factor Staining Buffer Set | ebioscience | 00-5523-00 | For intracellular transcription factor flow cytometry staining |
| Hu FcR Binding Inhibitor Purified | ebioscience | 14-9161-71 | |
| ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium | Stemcell Technologies | 10981 | "Serum-Free Base Media" |
| MACS CD28 pure functional grade, human | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | Clone: 15E8 |
| anti-human CD3 Purified | UCSF monoclonal antibody core | N/A | Clone: OKT-3 |
| LEAF purified anti-human IL-4 | Biolegend | 500815 | Clone: MP4-25D2 |
| anti-human IFNg, functional grade purified | ebioscience | 16-7318-85 | Clone: NIB42 |
| Recombinant human IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| Recombinant human IL-1β | Peprotech | 200-01B | |
| Recombinant human TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool Human RORC | Dharmacon | M-003442-00 | |
| siGENOME SMARTpool Human PTPRC | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | ThermoFisher Scientific | 11346D | Human CD4+ T cell Isolation Kit |
| Neon Tranfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Next generation electroporation instrument |
| Neon Tranfection System 10 μl Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Resuspension Buffer T | ThermoFisher Scientific | Provided in kit (MPK1096) | "Transfection Resuspension Buffer" |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | #07801 | Density Gradient Medium |
| costar 6-well tissue culture treated plates | Corning | 3516 | flat bottom plates |
| costar 48-well tissue culture treated plates | Corning | 3548 | flat bottom plates |
| BD Pharm Lyse lysing buffer, 10 X | BD biosciences | 555899 | Must make 1X solution with distilled water prior to use |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14 (9), 585-600 (2014).
- Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).
- Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).
- Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).
- Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).
- Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
- Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).
