RNA pequeno Transfecção em células primárias Th17 humano por Next Generation electroporação

As células T CD4 ⁺ são orquestradoras cruciais da resposta imunitária adaptativa. As células T CD4 ⁺ naive são capazes de se desenvolver em várias células T efectoras diferentes (por exemplo, Th1, Th2, Th17, etc), cada um com o seu próprio conjunto de citocinas característicos e factores de transcrição, dependendo do microambiente local ^1. As decisões da linhagem que as células T fazem são fundamentais tanto para a imunidade protetora e tolerância à auto. Culas Th17 são um subconjunto de células T conhecidos para combater bactérias extracelulares e fungos, mas as suas respostas erradas também está implicado na patogénese de várias doenças auto-imunes e inflamatórias tais como esclerose múltipla e psoríase ^{2, 3.} Culas Th17 humanos podem ser geradas a partir de células naive T CD4 ⁺ in vitro, proporcionando-lhes um ambiente de polarização apropriado ^4. Vario us combinações das citocinas IL-1β, IL-23, TGF-p e IL-6 foram utilizados para o desenvolvimento de células humanas Th17. Culas Th17 humano expressar CCR6, um receptor de quimiocina que é comumente utilizada para identificar esta população de células e são definidos pela expressão do seu principal factor de transcrição, RORγt (codificado por RORC) ^{5, 6.} culas Th17 têm a capacidade de expressar várias citocinas, mas a IL-17A é a citocina efectora definidora de linhagem produzida por estas células. Foi examinada a expressão de todos os três marcadores associados-Th17 (CCR6, RORγt, IL-17A) para avaliar a robustez do nosso ensaio de diferenciação humano Th17 in vitro. Além disso, foi realizada cultura de células CD4 ⁺ T humanas em condições não polarizadores, onde não há citoquinas ou anticorpos bloqueadores foram adicionados ao meio de cultura a utilizar como controlo negativo uma vez que a expressão destes marcadores Th17 deve ser muito baixa ou ausente.

ve_content "> Uma forma de estudar o desenvolvimento normal humana de células T e biologia é manipular a expressão de genes durante o seu desenvolvimento. Curto-ARN interferente (siRNA) são pequenas moléculas de ARN sintéticos que têm como alvo ARNm de codificação de proteínas e podem ser utilizados para reduzir a expressão do gene específico . MicroRNAs (miARNs) são endógenos não codificantes pequenos RNAs conhecidos para modular a expressão do gene de pós-transcricionalmente. miARNs foram mostrados para desempenhar um papel importante em ambos murino e biologia de célula T humana, incluindo em culas Th17 ^{7, 8, 9.} É é crucial ter métodos fiáveis ​​de manipulação de actividade de RNA pequeno em células T humanas de estudar os seus efeitos sobre a expressão do gene e, finalmente, sobre a biologia de célula T humana. Aqui, descrevemos um protocolo de fácil utilização, consistente e fiável que nós desenvolvido para introduzir pequenos RNAs sintéticos e ácidos nucleicos bloqueados (LNA, quimicamente modificado ácidos nucleicos com maior estabilidade)em células imunitárias e, especificamente, em células humanas Th17.

Existem vários métodos alternativos de introdução de pequenos RNAs em células de mamíferos, os quais geralmente caem em categorias químicas, biológicas, físicas ou ^10. métodos químicos normalmente utilizados, incluindo transfecções à base de lípidos e transfecções de fosfato de cálcio, confiaram na criação de complexos de ADN-químicas que são mais eficientemente absorvidos pelas células. Em geral, os métodos químicos não são tão eficazes para a transfecção de células T primárias. O método biológico mais comum é a utilização de um vector virai (por exemplo, retrovus ou lentivus), que insere directamente ARN estranho num hospedeiro como uma parte do seu ciclo de replicação natural. transdução virai tipicamente leva mais tempo para completar, especialmente quando um factores em tempo para a clonagem molecular de plasmeos provirais. Além disso, os vectores de transdução viral pode ser potencialmente prejudicial para os pesquisadores humanos. A electroporação é um m físicaétodo de induzir a permeabilização da membrana, sujeitando as células de impulsos de alta tensão, permitindo que os ácidos nucleicos de introduzir transitoriamente para dentro da célula, onde podem actuar sobre o alvo. instrumentos eletroporação tradicionais não foram eficazes para a transfecção de linfócitos primários. No entanto, a electroporação optimizado próxima geração tem provado ser capaz de transfectar células T na eficiência muito elevada, especialmente quando o material a ser transfectada é ARN pequeno. O termo próxima geração é livremente utilizado para diferenciar as duas plataformas mais recentes (por exemplo, néon, Amaxa) a partir de máquinas de electroporação tradicionais. Além disso, este método é facilmente escalável para telas rendimento moderado com um máximo de cerca de 120 pequenos RNAs de uma única experiência, muitas vezes utilizando reagentes sintéticos validados. Importante, as transfeces de sucesso pode ser conseguida em menos de 16 horas após a activação de células T. A desvantagem deste método, no entanto, é que não resulta em incorpor genómico estável, e é, portanto, transitórios. Por isso, é importante o esforço extra para criar uma construção de expressão estável, que pode ser embalado num vector virai e expresso com sucesso em células T em casos em que é necessária a expressão de longo prazo de um ARN pequeno.

Usámos uma próxima geração de transfecção (por exemplo, de néon) para proporcionar diversas ferramentas sintéticos simples ou de cadeia dupla de RNA ou de oligonucleidos de LNA para diferentes fins de ^{11, 12, 13.} interferência de ARN eficiente pode ser induzida no primário do rato e células T humanas utilizando ARN curta interferente de cadeia dupla (ARNip). Este protocolo descreve condições optimizadas para a utilização desta técnica em culas Th17 humanos. Além de siRNAs, disponíveis comercialmente imita miARN sintéticos e inibidores podem ser usados ​​para estudar o ganho de miARN e perda de função. imita miARN são moléculas de cadeia dupla de RNA muito semelhantes para os siRNAs, mas designed, com a sequência de miARNs maduros endógenos. inibidores de miARN são quimicamente modificados individuais oligonucleótidos de cadeia de ARN e / ou de LNA base que se ligam a miARNs nativas e antagonizam a sua função. Descobrimos que todas estas ferramentas podem ser usadas de forma eficaz em linfócitos T primárias cultivadas, incluindo mas não limitado a células Th17 humanos.