Massaspectrometrie en luminogene gebaseerde benaderingen voor karakteriseren Fase I Metabolic competentie van<em> In Vitro</em> Cell Cultures

OPMERKING: De algemene werkstroom van de metabolische activiteit assay is uiteengezet in Figuur 2. Elke stap van deze workflow wordt vervolgens in detail beschreven in de volgende paragrafen. Gedetailleerde tabellen van de reagentia en apparatuur zijn in de tabel van Materialen. Figuur 2: workflow voor Metabolic Probe Assay. De cellen worden uitgezet en gekweekt tot voldoende dichtheid. Een CYP inductie stap kan afhankelijk van de enzymactiviteit bepaald vereist. De sonde substraat en remmer wordt toegevoegd aan de celkweek. Na een incubatieperiode wordt het medium verzameld voor analyse en de cellen worden gelyseerd voor eiwit kwantificatie. Het mengsel wordt bewerkt voor analyse van het metabolische product van de probe substraat door massaspectrometrie of luminometrie.ad / 55502 / 55502fig2large.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 1. Cultuur van de Cel Figuur 3: Light Transmission Micrografie van een lever cellijn Culture. De cellijn in dit protocol 5 beschreven kenmerkend onderscheid met een splitsing tussen 50% en cholangiocyten hepatocyten in kweek (100x). Schaal bar = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Gestoorde cellijn cultuur OPMERKING: Een commercieel verkrijgbare lever cellijn werd gebruikt als een voorbeeld van metabolisch competente cellen. De cellijn werd afgeleid van een hepatocarcinoom veroorzaakt door virale infectie 7. Op confluentie deze cellijn differentieert in cholangiocyte- en hepatocyt-achtige cellen (figuur 3) en verdere details zijn te vinden in Guillouzo 7. De opname van 2% DMSO aan het kweekmedium steunt de differentiatie van de cellijn en expressie van een verscheidenheid van CYP. Verwijder het cryogene flesjes met cellen van de vloeibare stikstof en plaats op droogijs vervoer. Breng de cryovial een waterbad voorverwarmd tot 37 ° C gedurende 1-2 min en de buitenkant van het flesje met 70% ethanol gesteriliseerd alvorens in een laminaire stroming kap. Tijdens de werkzaamheden onder steriele omstandigheden voorzichtig openen cryogene flacon om overtollig ontlasten en pipetteer de inhoud van de cryogene flacon in een 10 ml buis gevuld met 9 ml voorverwarmde Williams' E-medium bij 37 ° C. Centrifugeer de oplossing gedurende 10 min bij 400 xg bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 mLproprietary dooi medium voorverwarmd bij 37 ° C, aangevuld met glutamine of glutamine supplement (2 mM eindconcentratie) (Williams E + glutamine supplement + ontdooien toevoegingen). Aantal levensvatbare cellen met behulp van een 500 gl aliquot met een celteller of andere geschikte cel teltechniek. Zaad de cellen in een 24 putjes met collageen beklede plaat bij een dichtheid van 0,6 x 10 6 levensvatbare cellen / putje in een eindvolume van 0,5 ml medium ontdooien. Plaats de plaat (s) in een incubator bij 37 ° C met 5% / 95% CO2 / lucht en 100% relatieve vochtigheid. 24 uur na uitzetten van de cellen vervangen van het medium met 0,5 ml voorverwarmde onderhoud / metabolisme werkmedium (Williams E + glutamine supplement + metabolisme te vullen (dit medium bevat reeds DMSO)). Verander het medium om de twee dagen. Na een paar dagen kweken van de cellen vormen een sub-confluente trabeculaire structuur (figuur 3). De optimale metaboleActiviteit kenmerkend waargenomen tussen dag 7 en 10 en het laagst op dag 4. Figuur 4: Dwarsdoorsnede van Alcian Blue Stained Airway cellen gekweekt op de Air-vloeistof Interface 8. Trilharen, slijm producerende en basale cellen zijn duidelijk zichtbaar. Schaal bar = 250 urn. Gedifferentieerde luchtwegepitheel culturen Opmerking: Het protocol is getoond met een in de handel verkrijgbaar volledig gedifferentieerde primaire luchtwegepitheel gegroeid bij de lucht-vloeistof grensvlak op een inzetstuk 8 (figuur 4). Weefselkweek behoudt een mucocilliary fenotype en celpolariteit 8. Cellen kunnen nasale of bronchiale oorsprong zijn. Hier, gebruik dan de menselijke neus cellen. De cellen worden geleverd op een cultuur plaat formaat met 24inserts in de lucht-vloeistof grensvlak. Om het transport te vergemakkelijken en te voorkomen dat medium morsen de inzetstukken worden geleverd met het basale gedeelte ingebed in een agarose matrix gemengd kweekmedium. Bij aflevering van de cellen, Steriliseer de platen die de inzetstukken 24 met een 70% ethanoloplossing voor het plaatsen in een schone laminaire stroming kap. Bereid een steriele plaat met 24 putjes door het toevoegen van voorverwarmd 700 pl eigen kweekmedium. Met steriele pincet overdracht van de cel inzetstukken aan de nieuwe plaat voorgeladen met medium door voorzichtig losmaken het inzetstuk uit de agarose matrix. Plaats de plaat (s) in een incubator bij 37 ° C met 5% / 95% CO2 / lucht en 100% relatieve vochtigheid. Elke 2 dagen de inserts dragen aan een nieuwe steriele 24-well plaat vooraf geladen met 700 ul warm proprietary luchtweg celkweekmedium. Beoordeel de integriteit van de luchtweg weefsel met behulp van werkwijzen, zoals trans-epitheliale weerstand (TEER) ofcilia verschilfrequentie (CBF) met gebruik van een microscoop uitgerust met een live video beeldvormingssysteem 9. De meting van TEER en CBF is beschreven in Kuehn 10. 2. CYP Activiteit Kwantificering in celkweken Opmerking: In het algemeen kunnen oplosmiddelen zoals DMSO en methanol worden om voorraadoplossingen te bereiden op de verschillende metabolische probes en remmers in dit document. Het wordt echter aanbevolen om de uiteindelijke DMSO concentratie in het kweekmedium tot een minimum (1% of lager) gehouden worden, aangezien hoge concentraties metabolische enzymen kunnen remmen. Indien mogelijk, verdient het aanbeveling om fenolrood vrij en serumvrij medium tijdens de incubatie met metabole probes aangezien fenolrood kan interfereren met CYP en Fase II enzymactiviteit en serum component zoals albumine kan de beschikbaarheid probe te verlagen. Het is niet altijd mogelijk om zich strikt aan deze richtlijnen. Bijvoorbeeld, de luchtwegen celkweekmedium is eigendom van en bevat fenol rood. Proprietary hepatische cellijn metabolisme medium 7 bevat reeds DMSO dan 1% zoals nodig is voor de cellen aan de hepatocyt-achtige fenotype aannemen. LET OP: Tot slot, hier is de term specifieke probe / inhibitor wordt gebruikt, maar deze terminologie dient te worden beschouwd met de nodige voorzichtigheid. Inderdaad, het is zeer zeldzaam voor een metabole probe een enzym exclusief substraat. De hier beschreven probes hebben echter een hoge affiniteit voor hun enzymdoel en daarom worden beschouwd als betrouwbare markers activiteit. Metabolische probes, inductoren en remmers Probes met massaspectrometrie gebaseerde werkwijzen OPMERKING: De probes en inhibitoren in dit hoofdstuk beschreven zijn geschikt om de activiteit van CYP2As 11 testen, CYP1A2 12,ref "> 13, CYP2B6 7, 14, CYP2F1 15, 16 en CYP2E1 17 door UPLC-massaspectrometrie. De sondes, inhibitoren en corresponderende CYP worden beschreven in Tabel 1 met overeenstemmende referenties aangeduid. Tabel 1 geeft eveneens de metaboliet met het CYP activiteit die wordt gekwantificeerd door middel van massaspectrometrie. alle werkzaamheden in weefselkweek en oplossingen voor gebruik in weefselkweek in een steriele weefselkweek kap te voeren. een voorraadoplossing in DMSO kan worden voorbereid op de sonde substraten. Voor het experiment voor te bereiden twee reeksen cel inzetstukken en putjes, gebruikt een serie voor de remming experiment, de andere alleen de metabolische probe. Bereid een derde reeks van cellen als een medium blanco controle. Ze kunnen op afzonderlijke platen of op dezelfde platen met minimaal drie herhalingen. Een voorbeeld van de plaat laguitgevoerd is weergegeven in figuur 5. Op de dag van het experiment, vervang dan de celcultuur medium met 450 ul van vers medium. Bereid in een steriele kap een 10 x concentratie van de volgende oplossingen via het celkweekmedium. Meng 10x CYP probe, 10x CYP remmer en 10x CYP remmer plus 10x probe. OPMERKING: Master voorraadoplossingen remmer en probe kan worden bereid in 100% DMSO (bijv 1000x voorraden) en verder verdund in medium tot een 10x oplossing te verkrijgen om een uiteindelijke DMSO-concentratie van meer dan 1% van de celkweek te voorkomen . De uiteindelijke 1x concentraties die zijn gericht op de incubatie met de cellen worden getoond in tabel 1. Filter de verschillende 10x probe-oplossing met een 0,2 urn spuitfilter. Voeg 50 ul van medium dat de CYP 10x remmer aan de reeks van cellen voorbereid voor de remming experiment en pre-incubeer gedurende 30 minuten. RVervang het medium van de cellen in de remming serie met 450 ul vers medium en voeg 50 ul medium dat zowel 10x CYP-remmer en 10x probe substraat. Naar de andere cellen 50 gl van het medium met de 10x probe substraat en voeg een equivalente hoeveelheid drager verdund in medium (bijvoorbeeld DMSO) aan de lege cel controles zoals getoond in figuur 5. Incubeer de cellen gedurende 0-5 minuten (tijdstip 0 achtergrondcontrole) en 16 uur in de celincubator. LET OP: Deze incubatietijd werd met succes gebruikt met de cellen van de luchtwegen en lever cellijn; echter verse primaire hepatocyten een hoge metabolische competentie, in afwachting van de kwaliteit van het celpreparaat en genetische donor, waardoor kortere tijden (bijvoorbeeld 2-4 uur) is bruikbaar. Het is altijd aan te raden om een ​​tijdsverloop experiment uit te voeren bij het testen van verschillende cellijnen of celtypen. Na afloop van de incubatieperiode collect het medium in afzonderlijke gemerkte buizen voor het kwantificeren van de metaboliet met de probes. Freeze het medium voor toekomstige verwerking. Lyseren van de cellen voor eiwit kwantificatie. OPMERKING: Elk standaard eiwit kwantificatie-kit en protocol geschikt voor deze stap. BCA is een geschikte optie. Deze stap is facultatief indien de cellen worden gebruikt in een andere assay. medium behandeling OPMERKING: De vanuit het incubatiestadium medium bevat de ouder probe chemische en metabolieten daarvan. Om een ​​specifieke CYP activiteit te meten alleen het product van de reactie gekatalyseerd door het CYP van belang moeten worden gekwantificeerd. Fase I metabolisme worden vaak verwerkt in combinatie met fase II metabolisme (conjugatie) en dus niet kan worden gedetecteerd als zodanig. Aldus teneinde de meest nauwkeurige kwantificering van CYP activiteit te verkrijgen, een deconjugerende stap is nodig om eventuele verwijderenFase II metabolisme modificatie. Aangezien conjugatie van fase I metabolieten gaat vaak glucuronidering en sulfatering wordt deconjugerende verkregen door behandeling van de monsters door glucuronidasen en sulfatasen 18. Glucuronidase en sulfatase activiteit is pH-afhankelijk met de hoogste glucuronidase activiteit bij pH 4,5-5,0 en sulfatase activiteit het hoogst bij pH 6,0-6,5 bereikt. Daarom is deze stap vereist aanpassing van de pH. Bij de hier beschreven methode, meten we de pH met behulp pH strips om praktische redenen, omdat de meeste pH meter probes niet passen in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Commercieel verkrijgbare pH strips kunnen worden gevonden met een resolutie vanaf 0,3-0,2 pH eenheden. Transfer 250 ul incubatiemedium een ​​1,5 ml microbuisjes en voeg 4-methylumbelliferon interne standaard voorraadoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 100 nM bereikt. De pH van het medium op 4,5-5,0 door toevoeging van 1 M HCl. Voeg 1 pl HCl per keer en controleer pHpipetteren 2 ul van medium op een pH strip. Bereiken van een pH van 5,0 zou typisch niet meer dan 5-10 pl 1 M HCl nodig. Voeg 150 eenheden (1,8 uL een 85.000 eenheid / ml voorraadoplossing) van β-glucuronidase / arylsulfatase van Helix pomatia en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Stop de reactie door toevoeging van 250 pi koude methanol (-20 ° C). Bewaar monsters bij -20 ° C of proces verder. Damp het oplosmiddel met behulp van een vacuüm centrifuge bij 45 ° C. Reconstitueren de monsters met 500 ul van een 30% acetonitril: wateroplossing. De monsters zijn klaar voor massaspectrometrie analyse en kan bij -20 ° C in amberkleurige glazen flesjes bewaard. Massaspectrometrie kwantificering LET OP: Alle UPLC en massaspectrometer instellingen worden gedetailleerd beschreven in de speciale Aanvullende tabel 1. Voor een kwantitatieve analyse, vaststelling van een ijkkromme vereist. de Caliijking curve wordt verkregen door een bekende verdunningsreeks van de verbinding te kwantificeren. In dit geval werden de kalibreringskrommen die meer dan 10 verschillende concentraties (tabel 2), ten minste 6 waarvan mag niet meer dan 20% van het lineaire traject 19. Laagste detectieniveau wordt bepaald als de laagste concentratie die een signaal groter dan of gelijk aan het gemiddelde achtergrondsignaal 3x geeft. Het laagste kwantificering wordt bepaald als het monster laagste concentratie die een signaal groter of gelijk is aan 10x het gemiddelde achtergrondsignaal beide worden bepaald over ten minste 3 onafhankelijke proeven met monsters in drievoud geeft. Bereid een seriële verdunning van een synthetische metaboliet in het weefsel cultuurmedium volgens Tabel 2, zoals de interne standaard. Een eindvolume van 250 pl per standaardverdunning voldoende. Damp het seriële verdunningen van standaard zoals beschreven in step 2.1.2.4 en resuspendeer in een volume van 30% acetonitril: water gelijk aan het volume van media voorafgaande verdamping (bijvoorbeeld 250 pl 30% acetonitril: water als het uitgangsmateriaal standaardoplossing werd 250 ul medium). Voeg 250 ul van elke seriële verdunning standaard UPLC een amber glazen flesje voor injectie in de UPLC-MS autosampler. Voeg de proefmonsters (250 pl) aan UPLC flesjes amber en plaats ze in de UPLC autosampler. Randomize alle flesjes. OPMERKING: De massaspectrometer configuratie gebruikten we een hybride triple quadrupool / lineaire ion trap massaspectrometer gekoppeld aan een UPLC beschreven in de aanvullende tabel 1. Andere platforms zouden verschillende software en configuratie hebben, maar zou vergelijkbaar zijn stappen om de kwantificering uit te voeren volgen. Voer het UPLC-MS met de instellingen vermeld in Tabel 1 Aanvullende afhankelijk van de specifieke probe te kwantificeren. Gebruikde "te kwantificeren – Bouw Kwantificering methode" tool in massaspectrometer kwantificeringshulpmiddelen (Table of Materials) om de kalibratiecurve van de verworven synthetische standaard en de interne standaard te genereren. Met de "Kwantificering Wizard" naar de monsterbatch en monsters te kwantificeren en uitvoeren van de "Kwantificering Method" selecteert. De massaspectrometer kwantificering software een spreadsheet de kwantificering waarden van de gewenste verbinding in elk testmonster. Probes met behulp van luminescentie gebaseerde methoden OPMERKING: luminogene sondes om een scala van CYP activiteiten te meten zijn in de handel verkrijgbaar; echter niet alle geschikt zijn voor celgebaseerde proeven. Hier wordt een protocol voorgesteld om de activiteit van CYP1A1 / CYP1B1 meten. CYP1A1 / 1B1 werd geselecteerd om te illustreren hoe de activiteit van induceerbare CYP testen en een voorbeeld van hoe luminogene probes kan worden gebruikt als alter geveninheems in massaspectrometrie gebaseerde methoden. Tabel 3 vat de concentratie en incubatietijd gebruikten we de cellen luchtwegen en hepatische cellijn; Echter, die zou moeten worden aangepast voor andere celtypen. Luminogene andere probes zijn in de handel verkrijgbaar en kunnen worden gebruikt als substraten voor verschillende CYP. Bereid voldoende cellen met een niet-geïnduceerde controle, een geïnduceerde test en een geïnduceerde + remmer testen omvatten. Een voorbeeld van een plaatindeling wordt getoond in figuur 5B. Om CYP1A1 / 1B1 induceren Incubeer de cellen met een uiteindelijke concentratie van 10 nM TCDD in medium gedurende 72 uur (kortere 24-48 uur kunnen ook geschikt zijn). LET OP: TCDD kankerverwekkend en teratogeen. Draag adequate beschermende uitrusting, herziening van de leverancier MSDS vel en het uitvoeren van een risicobeoordeling voor gebruik. Na deze periode, verwijder het medium, spoel de putten met PBS 3 keer, en voeg wat vers medium. Prior aan het incuberen van de cellen met de luminogene reporter probe, pre-incubeer de aangewezen subset van geïnduceerde cellen gedurende 30 minuten met een eindconcentratie van 10 uM CYP1A1 / 1B1 inhibitor, α-naftoflavon, in medium. Voeg de luminogene probe LUC-CEE (luciferine 6'-chloorethyl ether) bij een uiteindelijke concentratie van 50 uM tot de niet-geïnduceerde geïnduceerde en geïnduceerde cellen + remmer. Incubeer gedurende 4 uur in een celkweek incubator. Na afloop van de incubatietijd verzamelen van het medium voor het kwantificeren van de luminogene probe. Breng 25 pl kweekmedium een ​​witte ondoorzichtige plaat met 96 putjes en voeg 25 ul van de fabrikant luciferine detectiereagens. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Lees de plaat onmiddellijk met een luminometer. Spoel de cellen met PBS en lyseren op totaal eiwit kwantificering. Opmerking: Deze stap is optioneel als levende cellen worden bewaard voor toekomstige experimenten. ikt is echter belangrijk op te merken dat induceerders zoals TCDD toxisch zijn en zullen de cellen beschadigen. Tabel 1: Lijst van Metabolic Probes, Producten en Remmers met hun overeenkomstig enzym. Molecuulgewicht en aanbevolen concentraties gebruikt bij de luchtweg en levercellen zijn ook aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Voorgestelde 24 putjes plaatindeling een CYP assay. (A) De aanbevolen lay-out voor CYP constitutief tot expressie omvat een reeks van putten voor de blanco mediumDe metabole probe en de metabole probe plus remmer. Deze lay-out kan worden vermenigvuldigd met het aantal tijdstippen die worden getest. (B) voorbeeld layout voor induceerbare CYP omvat een reeks goed voor een medium spatie, een metabole probe alleen controle geïnduceerde cellen (bijvoorbeeld met TCDD) geïncubeerd met de probes en geïncubeerd met de probes en een remmer. Tabel 2: Verdunning van synthetische normen voor de ijkkrommen en Respectieve LOD en LOQ. De verdunningsreeks gebruikt kan variëren afhankelijk van de massaspectrometrie platform en gevoeligheid. Hier gebruikten we een hybride triple quadrupool / lineaire ion trap massaspectrometer gekoppeld aan een UPLC. Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur. Tabel 3: luminogene Probe, induceerder evenals remmer van CYP1A1 / 1B1 Assay. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.