Масс-спектрометрия и люминогенные подходы, основанные на Охарактеризуйте Фазу I метаболических компетентности в<em> In Vitro</em> Клеточные культуры

Примечание: Общий рабочий процесс для анализа метаболической активности изложен на рисунке 2. Каждый шаг этого процесса впоследствии подробно описан в следующих параграфах. Подробные таблицы реагентов и оборудования приведены в таблице материалов. Рисунок 2: Последовательность действий при метаболическом Probe Assay. Клетки высевают и выращивают до адекватной плотности. Индукционный шаг CYP может потребоваться в зависимости от активности фермента анализировали. Субстрат и ингибитор зонда добавляют к клеточной культуре. После периода инкубации среду собирали для анализа, и клетки лизируют для количественного определения белка. Среда обрабатывается для анализа метаболического продукта субстрата зонда с помощью масс-спектрометрии или luminometry.объявления / 55502 / 55502fig2large.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 1. Культура клеток Рисунок 3: Светопропускание Микрография из печени клеточной линии культуры. Линия клеток описаны в данном протоколе-обычно дифференцируется с 50% расколом между холангиоцит и гепатоцит в культуре (100й). Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Печеночная культуры клеток линии Примечание: коммерчески доступные линии печеночной клетки использовали в качестве примера метаболический компетентных клеток. Клеточная линия была получена из гепатокарциномы , вызванной вирусной инфекцией 7, При конфлюэнтности, эта клеточная линия дифференцируется в cholangiocyte- и гепатоцитов-подобных клеток (фиг.3) , и дальнейшие детали могут быть найдены в Guillouzo 7. Включение 2% ДМСО в культуральной среде поддерживает дифференциацию этой клеточной линии и экспрессии различных CYPs. Удалите криогенные флаконы с клетками из жидкого азота и помещают на сухой лед для транспортировки. Перенести криопробирку на водяной бане, предварительно подогретой до 37 ° С в течение 1-2 мин, и стерилизовать снаружи флакона с 70% -ным этанолом до размещения в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. Во время работы в стерильных условиях, осторожно откройте криогенный флакон, чтобы освободить любое избыточное давление и пипетку содержимого флакона криогенного в 10 мл пробирку, заполненную 9 мл среды Е подогретого Уильямса при 37 ° C. Центрифуга раствор в течение 10 мин при 400 мкг при комнатной температуре, отбросить супернатант и ресуспендирования клеток в 5 млзапатентованная оттепели среда предварительно нагревают при температуре 37 ° С, с добавлением глутамина или глутамина добавки (конечная концентрация 2 мМ) (Williams' Е + глутамин + дополнение оттаивание добавки). Количество жизнеспособных клеток с использованием 500 мкл аликвоты с помощью счетчика клеток или любым другим подходящим способом подсчета клеток. Семенной клетки в тарелке коллагена покрытием 24-луночного при плотности 0,6 × 10 6 жизнеспособных клеток / лунку в конечном объеме 0,5 мл среды оттепели. Поместите пластину (ы) в термостате при 37 ° С с 5% / 95% СО 2 / воздух и 100% относительной влажности. Через 24 ч после посева клеток, заменить среду с 0,5 мл предварительно нагретого обслуживания / метаболизма рабочей среды (Williams' E + глутамин + дополнение метаболизма добавки (эта среда уже содержит ДМСО)). Изменение среды каждые два дня. Через несколько дней в культуре клетки образуют подкласс-вырожденная структуру трабекулярной (рисунок 3). Оптимальная метаболическийАктивность, как правило, наблюдается между 7-й день и 10, и является самым низким в 4-й день. Рисунок 4: Поперечное сечение Альциановой Голубой Окраска клетки дыхательных путей , выращенной в воздушно-жидкостном интерфейсе 8. Ресничные, продуцирующих слизь и базальные клетки хорошо видны. Шкала бар = 250 мкм. Дифференцированные культуры эпителия дыхательных путей Примечание: Протокол показан с коммерчески доступного полностью дифференцированного первичного эпителия дыхательных путей , выращенных на границе раздела воздух-жидкость на вкладыш 8 (фиг.4). Культура ткани сохраняет мукоцилиарный фенотип и полярность клеток 8. Клетки могут быть назального или бронхиальной происхождения. Здесь используют носовые клетки человека. Клетки доставляются по формату культурального планшета с 24вставляет на границе раздела воздух-жидкость. Для того, чтобы облегчить транспортировку и избежать утечек среды вставки поставляется с базальной секцией встроенной в агарозной матрице, смешанной с культуральной средой. При доставке клеток, стерилизовать пластины, содержащие 24 вставки с 70% -ным раствором этанола до размещения в чистом ламинарном потоке. Подготовьте стерильный 24-луночный планшет, добавив предварительно нагретом 700 мкл культуральной среды патентованный. Использование стерильных пинцетов перенос вставки клеток на новую пластину предварительно нагруженной среды, осторожно выбивание вставки из агарозной матрицы. Поместите пластину (ы) в термостате при 37 ° С с 5% / 95% СО 2 / воздух и 100% относительной влажности. Каждые 2 дня передача вставок на новом стерильный 24-луночный планшет предварительно загруженный с 700 мкла теплой собственной дыхательными путями клеточных культуральной средой. Оценка целостности ткани дыхательных путей, используя методы, такие как транс-эпителиального сопротивления (TEER), илиреснички бьют частоту (CBF) с помощью микроскопа , снабженного системой 9 формирования изображения живого видео. Измерение TEER и CBF описан в Kuehn 10. 2. CYP активность Количественная в культурах клеток Примечание: В качестве общего правила, растворители , такие как ДМСО и метанола могут быть использованы для получения исходных растворов для различных метаболических зондов и ингибиторов , представленных в настоящем документе. Тем не менее, рекомендуется, чтобы сохранить конечную концентрацию ДМСО в культуральной среде до минимума (1% или ниже), так как высокие концентрации могут ингибировать метаболические ферменты. Когда это возможно, он также рекомендуется использовать фенол красный свободный и безсывороточную среду во время инкубации с метаболическими зондами, так как фенол красного цвет может помешать CYPs и активности ферментов II фазы и компоненте сыворотки, таким как альбумин может снизить доступность зонда. Это не всегда возможно строго придерживаться этих методические рекомендации. Так, например, в дыхательных путях клеточная культуральная среда является частной собственностью и содержит фенол красный. Собственная печеночная клеточная линия метаболизм среда 7 уже содержит ДМСО выше 1% , как это требуется для клетки принять гепатоцит-подобный фенотип. Примечание: И, наконец, здесь, термин специфического зонда / ингибитор используется , но эта терминология должна рассматриваться с осторожностью. В самом деле, это очень редко метаболический зонд представлять собой фермент эксклюзивный субстрат. Зонды, описанные здесь, однако, имеют высокое сродство к мишени их фермента и, следовательно, считаются надежными маркерами активности. Метаболические зонды, индукторы и ингибиторы Зонды с использованием методов, основанных масс-спектрометрии Примечание: Зонды и ингибиторы , описанные в этом разделе , являются подходящими для проверки активности CYP2As 11, CYP1A2 12,исе "> 13, CYP2B6 7, 14, CYP2F1 15, 16 и CYP2E1 17 с помощью UPLC-масса – спектрометрии. Зонды, ингибиторы и соответствующие CYP описаны в таблице 1 , с соответствующими ссылками. В таблице 1 также приведена метаболический продукт CYP деятельность, которая количественно с помощью масс-спектрометрии. Все работы, связанные культуры и решения тканей для использования в культуре ткани должна быть проведена в стерильной капот культуры ткани. Исходный раствор может быть получен в ДМСО для всех пробных субстратов. До начала эксперимента подготовить две серии клеточных вставок или скважин, использует одну серию для эксперимента ингибирования, а другая только для метаболического зонда. Подготовьте третью серию клеток в качестве среды пустого контроля. Они могут быть на отдельных пластинах или в одних и тех же пластинах с минимумом трех повторов. Пример пластины лежалииз представлен на рисунке 5. В день эксперимента, заменить клеточную культуральную среду с 450 мкл свежей среды. Подготовьте в стерильном капоте 10x концентрации из следующих растворов с использованием клеточных культуральной среды. Смешайте 10x CYP зонд, ингибитор CYP, 10x и 10x ингибитор CYP плюс 10x зонд. Примечание: Мастер исходные растворы ингибитора и зонда могут быть получены в 100% ДМСО (например, 1,000x запасы) и дополнительно разбавленные в средствах массовой информации , чтобы получить 10 – кратный раствор для того , чтобы избежать конечной концентрации ДМСО свыше 1% с культурой клеток , Конечные концентрации 1x, которые направлены для инкубации с клетками, показаны в таблице 1. Фильтр другого решения 10x зонда с шприцевым фильтром 0,2 мкм. Добавьте 50 мкл среды, содержащей ингибитор CYP 10x к серии клеток, полученных для ингибирования эксперимента и предварительно инкубируют в течение 30 мин. рeplace среду клеток в серии ингибирования с 450 мкл свежей среды и добавляют 50 мкл среды, содержащей как ингибитор CYP 10х и 10х подложку зонда. Добавить в другие ячейки 50 мкл среды с зондом подложки 10 – кратным и добавить эквивалентное количество транспортного средства , разбавленный в среде (например, ДМСО) в черновые контрольных клеток , как показано на рисунке 5. Инкубируйте клетки при 0 – 5 мин (время 0, контроль фона) и 16 ч в инкубаторе клеток. ПРИМЕЧАНИЕ: Это время инкубации было успешно использовано с клетками дыхательных путей и линией клеток печени; Однако свежие первичные гепатоциты имеют высокую метаболическую компетентность, до качества клеточного препарата и генетический состав донора, следовательно , более короткое время (например, 2-4 ч) может быть приемлемым. Всегда рекомендуются проводить эксперимент курсового времени при тестировании различных клеточных линий или типов клеток. В конце инкубационного периода, CollECT среда в отдельных промаркированных пробирках для количественного определения метаболического продукта из зондов. Замораживание среды для дальнейшей обработки. Лизировать клетки для белка квантификации. Примечание: Любой стандартный набор белков Количественного и протокол является подходящим для этого шага. ВСА один подходящий вариант. Этот шаг является необязательным, если клетки должны быть использованы в другом анализе. Средняя лечение Примечание: Среда собрана из инкубационной стадии содержит родительский химические зонда, а также его метаболические продукты. Для измерения удельной активности CYP только продукт реакции, катализируемой CYP интереса должны быть определены количественно. Фаза I продукты метаболизма часто обрабатываются в тандеме с вторым этапом метаболизма (конъюгацией) и, следовательно, не могут быть обнаружены как таковые. Таким образом, для того, чтобы получить наиболее точную количественную оценку активности в CYP, шаг деконьюгации требуется, чтобы удалить какой-либоФаза II метаболизма модификации. Так как конъюгация фазы I метаболитов часто включает глюкуронидацию или сульфатирование, деконьюгации достигается путем обработки образцов глюкуронидаз и сульфатазы 18. Глюкуронидаза и сульфатазы активность зависит от рН с самой высокой глюкуронидазы активности достигается при рН 4,5-5,0 и активность сульфатазы быть высоким при рН 6,0-6,5. Таким образом, этот шаг требует корректировки рН. В способе, описанном здесь, мы измеряем рН с помощью рН полоски по практическим соображениям, так как метр зонды наиболее рН не помещаются в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Коммерчески доступные полосы рН могут быть найдены с разрешением как низко как 0,3 до 0,2 единиц рН. Передача 250 мкл инкубационной среды в 1,5 мл микропробирки и добавляют 4-метилумбеллиферона внутренний стандарт исходного раствора, чтобы достичь конечной концентрации 100 нМ. Доводят рН среды до 4,5-5,0 добавлением 1 М HCl. Добавить 1 мкл HCl в то время и проверить рНс помощью пипетки 2 мкл среды на рН полосы. Достижение рН 5,0, как правило, не требуется не более 5-10 мкл 1 М HCl. Добавьте 150 единиц (1,8 мклы на 85000 единиц / мл) от запаса β-глюкуронидаза / арилсульфатаза от виноградной улитки и инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С. Остановить реакцию добавлением 250 мкл холодного метанола (-20 ° С). Хранить образцы при -20 ° C или процессе дальнейшего. Растворитель выпаривают с использованием вакуумной центрифуги при 45 ° C. Развести образцы с 500 мкл 30% ацетонитрила в: водный раствор. Образцы готовы для масс-спектрометрического анализа, и можно хранить при температуре -20 ° С в Амбер Гласс флаконов. Масс – спектрометрия на основе количественного определения Примечание: Все UP и масс – спектрометр настройка подробно описана в специальной Дополнительной таблице 1. Для количественного анализа, создание калибровочной кривой требуется. CaliКривое расслоение получаются путем выполнения известного диапазона разбавления соединения должны быть определены количественно. В этом случае калибровочные кривые были получены более 10 различных концентраций (Таблица 2), по меньшей мере , 6 из которых должно быть в пределах 20% от линейного диапазона 19. Самый низкий уровень обнаружения определяется как самая низкая концентрация, которая дает сигнал больше или равна 3x среднего сигнала фона. Самый низкий уровень количественной оценки определяются как образец самого низкой концентрации, которая дает сигнал больше или равен 10й среднее фонового сигнала оба из которых определяется по меньшей мере, 3 независимых опыты с образцами в трех повторах. Приготовьте серийное разведение синтетического метаболита в тканевой культуральной среде в соответствии с таблицей 2, в том числе внутреннего стандарта. Окончательный объем 250 мкл на стандартном разведении является адекватным. Упаривают серийные разведения стандарта, как описано в стер 2.1.2.4 и ресуспендируют в объеме 30% ацетонитрил: вода эквивалентен объему носителя предварительного испарения (например, 250 мкл 30% ацетонитрил: вода , если исходный стандартный раствор 250 мкл среда). Добавьте 250 мкл каждого последовательного разбавления стандарта до нтарного UPLC стеклянный флакон для инъекций в автосамплером UPLC-MS. Добавить тестовые образцы (250 мкл) до янтарного UPLC ампул и поместить их в автосамплера UPLC. Перемешать все ампулы. Примечание: Конфигурация масс – спектрометра мы использовали представляет собой гибрид тройного квадрупольные / линейной ионной ловушки масс – спектрометр , соединенный с UPLC подробным в Дополнительной таблице 1. Другие платформы будут иметь различное программное обеспечение и конфигурацию, но будут следовать аналогичным шагам, чтобы выполнить количественную оценку. Запуск UPLC-MS , используя параметры , описанные в таблице 1 Дополнительной в зависимости от конкретного зонда для количественной оценки. использование«количественного – Построить Количественный способ» инструмент в массовых инструментов спектрометр количественного определения (таблица материалов) для генерирования калибровочной кривой из полученного синтетического стандарта и внутреннего стандарта. Используйте «Количественное определение мастера», чтобы выбрать партию образцов и образцов для количественной оценки и выполнить команду «Количественное определение метода». Программное обеспечение масс-спектрометр Количественное отображает таблицу со значениями количественного целевого соединения в каждом тестируемом образце. Зонды , использующие люминесценция на основе методов Примечание: люминогенные зонды для измерения ряда мероприятий CYP является коммерчески доступным; Однако, не все они подходят для анализов на основе клеток. Здесь протокол представлен для измерения активности CYP1A1 / CYP1B1. CYP1A1 / 1B1 был выбран, чтобы проиллюстрировать, как для анализа активности индуцируемой CY и дать пример того, как люминогенные зонды может быть использована в качестве альтерародной для массовых методов спектрометрии на основе. В таблице 3 приведена концентрациями и инкубационное время мы использовали для клеток дыхательных путей и линии клеток печени; Однако, те, возможно, должны быть адаптированы для других типов клеток. Другие люминогенных зонды являются коммерчески доступными и могут быть использованы в качестве подложек для различных CYPs. Подготовьте достаточное количество клеток, чтобы включать в себя неиндуцируемую контроль, индуцированный тест, и индуцированный + ингибитор тест. Пример компоновки пластины показан на фигуре 5В. Для того, чтобы побудить CYP1A1 / 1B1, инкубировать клетки с конечной концентрацией 10 нМ ТХДД в среде в течение периода 72 ч (более короткие периоды от 24 до 48 ч также могут быть пригодны). ВНИМАНИЕ: ТХДД является канцерогеном и тератогенным. Используйте соответствующие средства защиты, ознакомьтесь с поставщиком MSDS лист и выполнить оценку риска перед использованием. После этого периода, удалить среды, промыть лунки с PBS, 3 раза, и добавить свежую среду. PrIOR для инкубации клеток с люминогенных репортерным зондом, предварительно инкубировать назначенное подмножество индуцированных клеток в течение 30 мин при конечной концентрации 10 мкМ CYP1A1 / 1B1 ингибитор альфа-naphthoflavone, в среде. Добавьте люминогенный зонд LUC-CEE (Люциферин 6'-хлорэтил эфир) при конечной концентрации 50 мкМ до неиндуцируемых, индуцированных и индуцированных + ингибитора клеток. Выдержите в течение 4 ч в инкубаторе для клеточных культур. В конце периода инкубации собирает среду для количественного определения люминогенного зонда. Передача 25 мкл культуральной среды в виде белого непрозрачного 96-луночного планшета и добавляют 25 мкл реагента для детекции люциферин от изготовителя. Инкубирую в течение 20 мин при комнатной температуре. Прочитайте пластину немедленно с помощью фотометра. Промыть клетки с PBS и лизируют для общего белка квантификации. Примечание: Этот шаг не является обязательным , если живые клетки сохраняются для будущих экспериментов. ят Однако важно отметить, что индукторы, такие как ТХДД токсичны и могут повредить клетки. Таблица 1: Список Метаболических Зондов, продукты, и ингибиторов с их соответствующим ферментом. Молекулярная масса и рекомендуемые концентрации, используемые при дыхательных путях и клетке печени также показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 5: Предлагаемые 24-луночного Layout Тарелка Выполнить CYP анализа. (А) Рекомендуемый макет для CYPs конститутивна экспрессируемой включает в себя ряд скважин для заготовки среды, Метаболический зонд, и ингибитор метаболического зонда плюса. Такая компоновка может быть умножена на количество временных точек, которые проходят испытания. (В) Примере компоновка для индуцируемых CYPs включает в себя ряд хорошо для средней заготовки, метаболический зонд только контроль, индуцированные клетки (например, с ТХДДОМ) инкубируют с зондами и инкубируют с зондами и ингибитором. Таблица 2: Разбавление синтетических стандартов , используемых для калибровочных кривых и соответствующей LODs и LOQs. Диапазон разбавления для использования может изменяться в зависимости от массовой платформы спектрометрии и чувствительности. Здесь мы использовали гибридный тройной квадрупольные / линейную ионной ловушки масс-спектрометр, связанный с UPLC. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этогоцифра. Таблица 3: люминогенный зонд, индуктор и Ингибитор для CYP1A1 / 1B1 анализ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.