Een IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model voor de<em> In Vivo</em> Lange termijn monitoring van inflammatoire reacties
Summary
De hier beschreven werkwijze maakt het mogelijk om visualisatie van IL-8 promotorafhankelijke ontstekingsactivering in de longen van muizen door middel van niet-invasieve bioluminescentie beeldvorming (BLI). Het zelfde dier kan meerdere keren tot BLI worden onderworpen tot maximaal twee maanden vanaf de tijd van afgifte van het luciferase reporterconstruct.
Abstract
Luchtwegontsteking wordt vaak geassocieerd met bacteriële infecties en vertegenwoordigt een belangrijke determinant van longziekte. De in vivo bepaling van de pro-inflammatoire mogelijkheden van verschillende factoren is uitdagend en vereist terminale procedures, zoals bronchoalveolaire lavage en de verwijdering van longen voor in-situ analyse, waardoor longitudinale visualisatie in dezelfde muis wordt uitgesloten. Hierin wordt longontsteking geïnduceerd door de intratracheale instillatie van Pseudomonas aeruginosa- kweek supernatant (SN) bij transiënte transgeniseerde muizen die het luciferase reportergen onder controle van een heterologe IL-8 runderpromotor uitdrukken. Luciferase expressie in de long wordt gecontroleerd door in vivo bioluminescente beeld (BLI) analyse over een periode van 2,5 tot 48 uur na de instillatie. De procedure kan meerdere keren worden herhaald binnen 2 – 3 maanden, waardoor de evaluatie van de ontstekingsrespons in dezelfde muizen mogelijk isDe noodzaak om de dieren te beëindigen Deze aanpak maakt het mogelijk om pro-en anti-inflammatoire factoren in realtime in de long te volgen en lijkt geschikt voor functionele en farmacologische studies.
Introduction
Chronische longziekten, zoals astma, chronische obstructieve longziekte (COPD), cystische fibrose (CF) en bronchiectase, worden gekenmerkt door luchtwegontsteking. Luchtwegontsteking wordt gekenmerkt door oedeem, celinfectie, T-lymfocyt- en mastcelactivering, verhoogde luchtwegafscheidingen en overmatige collageenafzetting. CF is een multisystemenstoornis, en de belangrijkste oorzaak van sterfte en morbiditeit is longbacteriële infectie met toenemende pulmonale exacerbatie. De daling van de longfunctie voorspelt een significant slechtere uitkomst 1 , 2 , 3 , 4 .
De ontstekingstoestand van de luchtwegen wordt meestal waargenomen door de evaluatie van immunologische markers die tijdens het ontstekingsproces worden gewerkt in materiaal afgeleid van de onderste en bovenste luchtwegen, zoals sputum, die variabele resULT's. Bronchoscopies worden ook uitgevoerd 5 . Murine modellen zijn waardevolle instrumenten voor het onderzoeken naar de pathogenese en de evolutie van ziekten die worden gekenmerkt door luchtwegontsteking en waarvoor effectieve behandelingen of behandelingen nog niet zijn geïdentificeerd. Diermodellen van longinfectie en ontsteking zijn gebruikt om astma- en gastropathogene interacties te bestuderen, met inbegrip van de rol van chemicaliën die de menselijke omstandigheden simuleren ( bijvoorbeeld blootstelling aan sigarettenrook, LPS, elastase, ovalbumine, poly I: C, enz . Ook als combinaties van bovenstaande) 6 . De meting van ontstekingsgerelateerde parameters vereist het offer van de dieren, aangezien invasieve benaderingen nodig zijn om factoren zoals bacteriële belasting, cytokinen in de longen en verzamelde bronchoalveolaire lavage (BAL) vloeistof te meten. Ook histologische onderzoeken zijn vaak nodig. De mogelijkheid om informatie te verkrijgen over de ontstekingsrespons kinetiek vereist het gebruik van numErge muizen. Daarom is een techniek die het mogelijk maakt om dergelijke informatie te verkrijgen zonder dat de dieren moeten worden opgeofferd, waardevol op technische, ethische, economische en operationele basis.
IL-8 is een essentiële speler in het ontstekingsproces, waarbij leukocyten worden aangewakkerd aan het ontstoken weefsel. Het is een moleculaire uitlezing voor de studie van de ontsteking van de ontstekingsweg. MIP-2 en KC kunnen functionele homologen van menselijk IL-8 in muizen zijn. Muizen uiten slechts één potentiële IL-8 receptor, een homoloog van humane CXCR2 7 , 8 , maar ze zijn in staat om een heterologe IL-8 gen promotor te moduleren die een reporter gen drijft. Een muizenmodel met longontsteking is onlangs ontwikkeld na de waarneming dat een runder IL-8 promotor / luciferase reporterconstruct in muizen kan worden geactiveerd. Deze functie maakt het gebruik van bioluminescentie beeldvorming (BLI) mogelijk om de ontstekingsrespons in het leven van a te controlerenNimals 9 .
Dit model is aangepast om ontsteking te onderzoeken die wordt veroorzaakt door bacteriële exoproducten ( bijv. LPS of producten die door bacteriestammen worden vrijgegeven) of TNFalpha 10 , 11 . Het geneesmiddel ontdekkingsproces is gericht op de ontwikkeling en optimalisatie van oude en nieuwe anti-inflammatoire moleculen die longziekten kunnen behandelen, zoals CF, astma en COPD. Deze nieuwe chemische entiteiten moeten snel en gemakkelijk worden getest in diermodellen die gekoppeld kunnen zijn aan specifieke klinische fenotypen om het ontwerp van slimme klinische proeven te vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In een eerdere werk 11 werd een contrast weergegeven tussen bIL-8-Luc-afhankelijke BLI en BAL markers. Het vertrouwde op de differentiële mate van gevoeligheid binnen muisstammen 12 . Om deze reden vereist de eerste toepassing van het bIL-8-Luc model op een andere muisstam een initiële studie van de ontstekingsreactie, zowel in termen van BLI als meer gestandaardiseerde ontstekingsmarkers.
Muizentransfectie veroorzaakt milde longontstek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Italiaanse Cystic Fibrosis Foundation Project FFC # 18/2013, FFC # 29/2015 en door de Italiaanse Cystic Fibrosis League via de Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5ml | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 ml (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1ml | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Barnes, P. J. Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes. J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).
- Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. Airway inflammation in cystic fibrosis: molecular mechanisms and clinical implications. Thorax. 68 (12), 1157-1162 (2013).
- Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies. Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).
- Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease. Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).
- Sagel, S. D. Noninvasive biomarkers of airway inflammation in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 9 (6), 516-521 (2003).
- Starkey, M. R., et al. Murine models of infectious exacerbations of airway inflammation. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 337-344 (2013).
- Cacalano, G., et al. Neutrophil and B cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog. Science. 265 (5172), 682-684 (1994).
- Simonet, W. S., et al. Long-term impaired neutrophil migration in mice overexpressing human interleukin-8. J Clin Invest. 94 (3), 1310-1319 (1994).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PLoS One. 7 (6), e39716 (2012).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS One. 9 (9), e106873 (2014).
