Модель переходной трансгенерации IL-8 для<em> В Виво</em> Долгосрочный мониторинг воспалительных реакций
Summary
Описанный здесь способ позволяет визуализировать активацию IL-8-зависимого воспаления в легких мышей посредством неинвазивной биолюминесцентной визуализации (BLI). Одно и то же животное может быть подвергнуто BLI несколько раз в течение двух месяцев с момента доставки конструкции репортера люциферазы.
Abstract
Воспаление дыхательных путей часто ассоциируется с бактериальными инфекциями и является основным фактором, определяющим заболевание легких. Определение in vivo провоспалительных возможностей различных факторов является сложным и требует терминальных процедур, таких как бронхоальвеолярный лаваж и удаление легких для анализа in situ , исключая продольную визуализацию у той же мыши. Здесь воспаление легких индуцируется путем интратрахеальной инстилляции супернатанта культуры Pseudomonas aeruginosa (SN) у временно трансгенных мышей, экспрессирующих репортерный ген люциферазы под контролем гетерологичного промотора коровы IL-8. Экспрессия люциферазы в легких контролируется анализом биолюминесцентного изображения in vivo (BLI) в течение 2,5-48-часовой таймфрейма после инстилляции. Процедуру можно повторять несколько раз в течение 2 – 3 месяцев, что позволяет оценить воспалительную реакцию у одних и тех же мышей сНеобходимость прекращения животных. Такой подход позволяет контролировать про-и противовоспалительные факторы, действующие в легких в реальном времени, и представляется пригодным для функциональных и фармакологических исследований.
Introduction
Хронические заболевания легких, такие как астма, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), кистозный фиброз (CF) и бронхоэктазы, характеризуются воспалением дыхательных путей. Воспаление дыхательных путей характеризуется отеком, клеточной инфильтрацией, активацией Т-лимфоцитов и тучных клеток, увеличением выделения дыхательных путей и чрезмерным осаждением коллагена. CF является мультисистемным расстройством, и его основной причиной смертности и заболеваемости является бактериальная инфекция легких с увеличением обострения легочной артерии. Снижение функции легких предсказывает значительно худший результат 1 , 2 , 3 , 4 .
Состояние воспаления дыхательных путей обычно наблюдается путем оценки иммунологических маркеров, набранных во время воспалительного процесса, в материалах, полученных из нижних и верхних дыхательных путей, таких как мокрота, которая обеспечивает переменные resULTS. Бронхоскопия также выполняется 5 . Молекулы мурина являются ценными инструментами для исследования патогенеза и развития заболеваний, характеризующихся воспалением дыхательных путей, и для которых эффективные методы лечения или лечения еще не определены. Для изучения астмы и взаимодействия хозяина-патогена использовались животные модели инфекции легких и воспаления, включая роль химических веществ, которые имитируют состояние человека ( например, воздействие сигаретного дыма, LPS, эластаза, овальбумин, поли I: C и т. Д. , Как А также комбинации вышеуказанного). 6 . Измерение параметров, связанных с воспалением, требует жертвоприношения животных, так как необходимы инвазивные подходы для измерения таких факторов, как бактериальная нагрузка, цитокины в легких и собранная жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Кроме того, гистологические обследования часто требуются. Возможность получения информации о кинетике воспалительных реакций требует использования numМышей. Поэтому метод, позволяющий получать такую информацию без необходимости жертвовать животными, ценен на технических, этических, экономических и эксплуатационных основаниях.
IL-8 является существенным игроком в процессе воспаления, рекрутируя лейкоциты в воспаленную ткань. Он представляет собой молекулярное считывание для изучения активации воспалительного пути. MIP-2 и KC могут быть функциональными гомологами человеческого IL-8 у мышей. Мыши экспрессируют только один потенциальный рецептор IL-8, гомолог человека CXCR2 7 , 8 , но они способны модулировать гетерологичный промотор гена IL-8, который управляет репортерным геном. Недавно была разработана модель мышиного воспаления легкого, после того как было обнаружено, что конструкция мышиного рецептора IL-8 / люциферазы может быть трансактивирована у мышей. Эта функция позволяет использовать биолюминесцентную визуализацию (BLI) для мониторинга воспалительного ответа при жизни9 .
Эта модель была адаптирована для изучения воспаления, вызванного бактериальными экзопроводами ( например, LPS или продуктами, высвобождаемыми бактериальными штаммами) или TNFalpha 10 , 11 . Процесс открытия лекарств ориентирован на разработку и оптимизацию старых и новых противовоспалительных молекул, которые могут лечить заболевания легких, такие как CF, астма и ХОБЛ. Эти новые химические объекты должны быть быстро и удобно протестированы на животных моделях, которые могут быть связаны с конкретными клиническими фенотипами, чтобы облегчить разработку интеллектуальных клинических испытаний.
Protocol
Representative Results
Discussion
В предыдущей работе 11 был показан контраст между bIL-8-Luc-зависимыми BLI и BAL-маркерами. Он полагался на дифференциальную степень чувствительности внутри мышей 12 . По этой причине первое применение модели bIL-8-Luc к другому штамму мыши требует первоначального изучени…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана проектом итальянского проекта кистозного фиброза FFC № 18/2013, FFC № 29/2015 и итальянской линией мускулистого фиброза через Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5ml | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 ml (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1ml | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Barnes, P. J. Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes. J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).
- Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. Airway inflammation in cystic fibrosis: molecular mechanisms and clinical implications. Thorax. 68 (12), 1157-1162 (2013).
- Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies. Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).
- Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease. Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).
- Sagel, S. D. Noninvasive biomarkers of airway inflammation in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 9 (6), 516-521 (2003).
- Starkey, M. R., et al. Murine models of infectious exacerbations of airway inflammation. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 337-344 (2013).
- Cacalano, G., et al. Neutrophil and B cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog. Science. 265 (5172), 682-684 (1994).
- Simonet, W. S., et al. Long-term impaired neutrophil migration in mice overexpressing human interleukin-8. J Clin Invest. 94 (3), 1310-1319 (1994).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PLoS One. 7 (6), e39716 (2012).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS One. 9 (9), e106873 (2014).
