גישה G-quadruplex זיקה-DNA עבור טיהור של enzymatically Active G4 Resolvase1
Summary
G4 Resolvase1 נקשר G-quadruplex (G4) מבנים עם זיקה המדווחת ההדוקה עבור חלבון G4 מחייב ומייצג את מרבית הפעילות ההתרה G4-DNA בתאים הלה. אנו מתארים פרוטוקול רומן שמנצל את הזיקה ופעילות התרה תלויה ATP של G4-Resolvase1 לטהר במיוחד קטליטית G4R1 רקומביננטי הפעיל.
Abstract
מהסוג-הגבוה-יותר מבני חומצות גרעין בשם G-quadruplexes (G4S, מבני G4) עלול להצטבר באזורים עתיר גואנין הוא DNA ו- RNA והם מאוד יציבות תרמית. ישנם> 375,000 רצפים G4 יוצרי המשוערת בגנום האנושי, והם מועשרים באזורי אמרגן, אזורים מתורגמים (UTRs), ובתוך חוזרי telomeric. בשל פוטנציאל מבנים אלה כדי להשפיע על תהליכים תאיים, כגון שכפול שעתוק, התא התפתח אנזימים כדי לנהל אותם. אנזים אחד כזה הוא G4 Resolvase 1 (G4R1), אשר היה שותף מאופיין ביוכימית ידי מעבדה שלנו Nagamine et al. , ונמצא שהיא נקשרת בצורה חזקה ביותר לשני (ד K בטווח הנמוך-PM) G4-דנ"א G4-RNA. G4R1 הוא המקור של רוב הפעילות-בפתרון G4 lysates התא הלה ומאז היה מעורב לשחק תפקיד במטבוליזם הטלומרים, פיתוח הלימפה, שעתוק גנים, hematopoiesis, ומעקב חיסוני. יכולת EFficiently להביע ולטהר קטליטית פעילה G4R1 היא בעלת חשיבות למעבדות מעוניינות להשיג תובנה נוספת לתוך האינטראקציה הקינטית של מבני G4 ואנזימים-בפתרון G4. כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לטיהור רקומביננטי G4R1 (rG4R1). ההליך המתואר משלב את טיהור הזיקה המבוססת המסורתית של אנזים היסטידין מתויג בטרמינל C-הביעה בחיידקי קודון אופטימיזציה אדם עם הניצול של היכולת של rG4R1 להיקשר ולהירגע-DNA G4 לטהר אנזים פעיל מאוד בתוך ATP- צעד elution תלוי. הפרוטוקול כולל גם צעד בקרת איכות שבו הפעילות האנזימטית של rG4R1 נמדדת על ידי בחינת היכולת של האנזים מטוהר להירגע G4-DNA. שיטה גם מתוארת כי מאפשרת כימות של rG4R1 המטוהר. עיבודים אלטרנטיביים של פרוטוקול זה הם דנו.
Introduction
מבני G4 הם מבנים משניים מאוד יציבים חומצות גרעין היוצרים בתוך האזורים עשירים-גואנין של DNA ו- RNA. מבני G4 מיוצבים באמצעות אינטראקציות מליטות Hoogsteen ולתאם מליטה בתוך החלל המרכזי עם קטיונים חד ערכיים (כלומר. K + ו + Na) שתורמים משמעותי ליציבות התרמית המדהימה של מבני G4 1, 2. מחקרים ביואינפורמטיקה מוקדם הציע כי הגנום האנושי מכיל> 375,000 "מוטיבים G4 יוצרי פוטנציאל" 3, 4. עוד הערכות מחקר שנערך לאחרונה עולה כי מספר מוטיבים G4 גבוה בפקטור של 2-5 5, ואילו במחקר אחר צופה 716,310 רצפי G4 יוצרי פוטנציאל מובהק בגנום האנושי 6. G4 יוצרי רצפים שמורים באבולוציה ולא התפזרו באופן אקראיהגנום. מוטיבי G4 מועשרים באזורי קידוד גן, ולמעלה מ -40% מכלל יזמי הגן מכילים G4 מוטיבים 7. מעניין לציין, כי מידת העשרת מוטיבים G4 בגן הודגמה להציע את הפונקציה של הגן. לדוגמא, פרוטו-אונקוגנים וגנים מעורבים בפיתוח באופן משמעותי העשרה גדול של מבני G4 מאשר גני מדכאי סרטן 8, 9.
עם יציבות תרמית גבוהה, נוכחות בכל מקום כמעט לאורך הגנום, ואת הפוטנציאל להשפיע על תהליכים סלולריים גדולים משמעותי, אין זה מפתיע לגלות כי התא התפתח אנזימים לנהל את המבנים האלה. אנזים אחד כזה הוא G4 Resolvase1 (G4R1; המכונה גם RHAU ו DHX36), אשר אפיינו כמקור של רוב פעילות בפתרון tetramolecular G4-דנ"א אנושי (הלה) תאים 10. מאז, הוכח that G4R1 ומסוגר המחבר ואת קטליטית unwinds ו tetramolecular unimolecular G4-דנ"א G4-RNA עם KDS המדווחת ההדוקה עבור חלבון G4 מחייב 11, 12, 13. בנוסף, הפעילות-בפתרון G4 של G4R1 הייתה מעורבת במגוון רחב של תהליכים ביוכימיים הסלולר, כוללים ביולוגיה הטלומרים / טלומרז 11, 14, 15, 16, שעתוק שחבור 17, 18, 19, 20, פיתוח 21, hematopoiesis תקנה 21, והמערכת החיסונית 22, 23. עם רצפים עליונים של G4 ממוקם במיוחד לאורך הגנום ואת p הסלולר המגווןrocesses כי G4R1 היה מעורב לאחרונה להיות מעורבים עם, היכולת להביע ולטהר ביעילות מאוד פעיל rG4R1 יהיה בעל חשיבות עליונה עבור הבהרת המנגנונים הביוכימיים והתנהגויות של חלבון זה.
הנה, אנחנו מדגימים ביטוי ברומן ואת ערכת טיהור (איור 1) שמנצל של ATP התלוי, הפעילות-בפתרון G4 של rG4R1 לבודד אנזים פעיל ביעילות. תכנית זו יכולה להיות מותאמת לטהר אנזימי חומצות גרעין תלוי ATP אחרים עבורו המוצר של התגובה האנזימטית הוא כבר לא מצע לכריכה, כפי שנהוג עבור G4R1.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מייצג ערכת ביטוי, טיהור יעילה ביותר, וכימות עבור הבידוד של מוצר גן DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, המכונה גם RHAU ו DHX36) (איור 1). פרוטוקול זה מנצל שני צעדי טיהור: טיהור זיקת התג שלו על חרוזי זיקת קובלט וטיהור האנזימטית על חרוזי G4-DNA מצומדות. השלב האחרון הוא ייחודי בכך ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות מקורות המימון שלנו, כולל מתנה נדיבה מקרן ור (כדי JPV), המכונים הלאומיים HealthGrant T32-CA079448 (כדי PJS), וקרנות ההפעלה אוניברסיטת בול סטייט (כדי PJS). המממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or From standard source |
| 1 M Tris-HCl pH=7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or From standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH=6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH=7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or From standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or From standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or From standard source |
| 0.2 M EDTA, pH=6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10 % Sodium dodecyl sulfate | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or From standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | From standard source | ||
| 500 ml centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
References
- Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).
- Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes. Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).
- Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).
- Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter. Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).
- Eddy, J., Maizels, N. Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome. Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).
- Eddy, J., et al. G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary. Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).
- Creacy, S. D., et al. G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).
- Sexton, A. N., Collins, K. The 5′ guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).
- Smaldino, P. J., et al. Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3′-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding. PLoS One. 10 (7), e0132668 (2015).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1. Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).
- Huang, W., et al. Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5′-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1. Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).
- Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).
- Yoo, J. S., et al. DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation. PLoS Pathog. 10 (3), e1004012 (2014).
- Lai, J. C., et al. The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis. Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).
- Zhang, Z., et al. DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells. Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).
- Kim, T., et al. Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).
- Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU. Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).
- Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).
