Een G-quadruplex DNA-affiniteit Aanpak voor zuivering van enzymatisch actieve G4 Resolvase1
Summary
G4 Resolvase1 bindt aan G-quadruplex (G4) met de kleinste structuren gerapporteerde affiniteit voor een G4-bindend eiwit en vertegenwoordigt het merendeel van de G4-DNA afwikkelen activiteit in HeLa-cellen. We beschrijven een nieuw protocol dat de affiniteit en ATP-afhankelijke afwikkelen activiteit van de G4-Resolvase1 gordels om specifiek te zuiveren katalytisch actieve recombinant G4R1.
Abstract
Hogere orde nucleinezuurstructuren genaamd G-quadruplexen (G4, G4 structuren) kunnen vormen in guanine-rijke gebieden van zowel DNA als RNA en zeer thermisch stabiel. Er zijn> 375.000 vermoedelijke G4 vormende sequenties in het humane genoom, en ze zijn verrijkt in promotergebieden, ongetranslateerde gebieden (UTR) en in de telomere repeat. Vanwege de mogelijkheid van deze structuren om cellulaire processen zoals replicatie en transcriptie beïnvloeden, de cel geëvolueerd enzymen te beheren. Een dergelijke enzym G4 resolvase 1 (G4R1), die biochemisch werd mede gekenmerkt door laboratoriumwaarden Nagamine et al. en bleek zeer stevig aan beide G4-DNA en G4-RNA (K d in de low-pM range) te binden. G4R1 is de bron van de meeste G4 oplossen activiteit in HeLa cellysaten en is sindsdien geïmpliceerd een rol telomeren metabolisme, lymfe ontwikkeling, gentranscriptie, hematopoiese en immune surveillance spelen. De mogelijkheid om efdoende te uiten en te zuiveren katalytisch actieve G4R1 van belang is voor laboratoria geïnteresseerd zijn in het verkrijgen van meer inzicht in de kinetische interactie van G4 structuren en G4 oplossen van enzymen. We beschrijven hier een gedetailleerde werkwijze voor de zuivering van recombinant G4R1 (rG4R1). De beschreven werkwijze omvat de traditionele affiniteit gebaseerde zuivering van een C-eindstandige histidine-gemerkte enzym tot expressie gebracht in humane codon-geoptimaliseerd bacteriën het gebruik van het vermogen van rG4R1 te binden en te ontspannen G4-DNA zeer actieve enzym te zuiveren per ATP afhankelijke elutiestap. Het protocol een kwaliteitscontrole stap waarbij de enzymatische activiteit van rG4R1 wordt gemeten door het onderzoeken van het vermogen van het gezuiverde enzym DNA-G4 ontspannen. Een werkwijze wordt ook beschreven dat zorgt voor de kwantificering van gezuiverde rG4R1. Alternatieve aanpassingen van dit protocol worden besproken.
Introduction
G4 structuren zijn zeer stabiel nucleïnezuur secondaire structuren die zich vormen binnen guanine-rijke gebieden van DNA en RNA. G4 structuren worden gestabiliseerd via Hoogsteen-waterstofbruggen en coördineren binding binnen de centrale holte met eenwaardige kationen (bijv. K + en Na +) die aanzienlijk bijdragen aan de opmerkelijke thermische stabiliteit van G4 structuren 1, 2. Vroege bioinformatica studies suggereerden dat het menselijk genoom bevat> 375.000 "potentieel-G4 vormende motieven" 3, 4. Meer recent onderzoek blijkt dat het aantal motieven G4 hoger met een factor van 02-05 mei, terwijl een andere studie voorspelt 716.310 verschillende potentiaal G4 vormende sequenties in het humane genoom 6. G4-vormende sequenties zijn evolutionair geconserveerd en niet willekeurig verspreid inhet genoom. G4 motieven zijn verrijkt in genen coderende gebieden en ruim 40% van gen promoters bevatten G4 motieven 7. Interessant is dat de verrijking van G4 motieven in een gen aangetoond dat het de functie van het gen suggereren. Bijvoorbeeld, proto-oncogenen en genen betrokken bij ontwikkeling aanzienlijk grotere verrijking van G4 structuren dan tumorsuppressorgenen 8, 9.
Met een hoge thermische stabiliteiten, een bijna alomtegenwoordige aanwezigheid in het genoom, en het potentieel aanzienlijk beïnvloeden belangrijke cellulaire processen, is verrassend te vinden dat de cel enzymen geëvolueerd om deze structuren te beheren. Een dergelijke enzym G4 Resolvase1 (G4R1, ook wel Rhau en DHX36), die we gekarakteriseerd als de bron van de meeste tetramolecular G4-DNA oplossen activiteit in menselijke (HeLa) cellen 10. Sindsdien is aangetoond that G4R1 stevig bindt en katalytisch wikkelt tetramolecular en unimoleculaire DNA-G4 en G4-RNA met de kleinste gemelde KD voor een G4-bindend eiwit 11, 12, 13. Daarnaast heeft de G4 oplossen activiteit van G4R1 betrokken bij een groot aantal biochemische en cellulaire processen, waaronder telomere / telomerase biologie 11, 14, 15, 16, transcriptie en lassen 17, 18, 19, 20, ontwikkeling 21, hematopoiese 21, en het immuunsysteem regelgeving 22, 23. Met een overwicht van G4 sequenties specifiek gelegen in het hele genoom en de diverse cellulaire processes dat G4R1 onlangs geïmpliceerd betrokken zijn bij het vermogen om expressie en efficiënt zuiveren zeer actieve rG4R1 daarbij van het grootste belang zijn voor het ophelderen van de biochemische mechanismen en het gedrag van dit eiwit.
Hier tonen we een nieuwe expressiesystemen en zuiveringsschema (figuur 1) die gebruik maakt van de ATP-afhankelijke, G4 oplossen activiteit van rG4R1 actieve enzym efficiënt isoleren. Deze regeling kan worden aangepast aan andere ATP-afhankelijke enzymen nucleïnezuur waarvoor het product van de enzymatische reactie is niet langer een substraat voor binding te zuiveren, zoals het geval is voor G4R1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is een zeer efficiënte expressie, zuivering en kwantificering regeling voor de isolatie van het DHX36 genproduct, G4-Resolvase1 (G4R1, ook wel Rhau en DHX36) (figuur 1). Dit protocol maakt gebruik van twee zuivering stappen: His-tag affiniteit zuivering op kobalt affiniteit kralen en enzymatische zuivering op G4-DNA-geconjugeerde kralen. De laatste stap is uniek omdat het profiteert van de strakke affiniteit, hoge specificiteit en afwikkelen katalytische activiteit die rG4R1 heeft voor G4 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken onze financieringsbronnen, met inbegrip van een gulle gift van de Ware Foundation (naar JPV), The National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (naar PJS), en Ball State University opstarten fondsen (tot PJS). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or From standard source |
| 1 M Tris-HCl pH=7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or From standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH=6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH=7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or From standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or From standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or From standard source |
| 0.2 M EDTA, pH=6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10 % Sodium dodecyl sulfate | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or From standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | From standard source | ||
| 500 ml centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
References
- Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).
- Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes. Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).
- Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).
- Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter. Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).
- Eddy, J., Maizels, N. Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome. Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).
- Eddy, J., et al. G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary. Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).
- Creacy, S. D., et al. G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).
- Sexton, A. N., Collins, K. The 5′ guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).
- Smaldino, P. J., et al. Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3′-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding. PLoS One. 10 (7), e0132668 (2015).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1. Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).
- Huang, W., et al. Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5′-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1. Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).
- Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).
- Yoo, J. S., et al. DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation. PLoS Pathog. 10 (3), e1004012 (2014).
- Lai, J. C., et al. The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis. Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).
- Zhang, Z., et al. DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells. Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).
- Kim, T., et al. Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).
- Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU. Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).
- Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).
