Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

La possibilità di visualizzare importanti processi di sviluppo in un vertebrato in vivo ha contribuito a rendere il pesce zebra un modello chiave per lo studio condizioni normali e di malattia (recensione in ^{1, 2).} In particolare, la retina neurale è una parte accessibile del sistema nervoso centrale. La retina si presta per effettuare facilmente studi di neurogenesi per la sua altamente organizzata, ma struttura relativamente semplice, ed i suoi tipi di neuroni altamente conservati tra le specie di vertebrati ^3. Dinamica dei comportamenti cellulari come la proliferazione, l'uscita del ciclo cellulare, la divisione cellulare asimmetrica, specifica il destino, la differenziazione, e la formazione di circuiti neurali possono essere seguiti durante tutto il processo di retinogenesi, che si completa nella retina centrale del pesce zebra da 3 d postfertilization ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Inoltre, i requisiti funzionali dei diversi geni in ciascuna delle fasi di cui sopra possono essere contemporaneamente valutati nella retina zebrafish, fornendo un vantaggio rispetto ad altri modelli di vertebrati in cui fenotipi derivanti dall'applicazione di tecniche di gene knockout può essere valutata solo dopo l'esame post-mortem di fisso tessuti. In particolare, l'uso di linee transgeniche in cui possiamo visualizzare e monitorare l'espressione di proteine ​​fluorescenti come transgeni giornalista nella retina, ci permette di ottenere risoluzione temporale di espressione genica che sottende la genesi di un particolare tipo di cellule neuronali. A causa del rapido sviluppo di zebrafish, questi eventi possono essere visualizzati durante l'intero periodo di sviluppo, fornendo in tal modo una più profonda comprensione sull'importanza temporale di espressione genica in relazione all'acquisizione identità delle cellule neuronali e il comportamento delle cellule.

Infine, questi approcci possono essere combinati in modo efficiente nel pesce zebra con la generazione di chimere via trapianti, con conseguente intuizioni in due aspetti fondamentali della funzione del gene. In primo luogo, esaminando le cellule trapiantate da un embrione donatore, in cui un particolare gene è stato abbattuto mentre si sviluppano in un ambiente senza etichetta wild type, ci permette di ottenere le informazioni pertinenti circa la funzione del gene in modo cellula-autonomo. Questo porta a importanti intuizioni circa la funzione di fattori destino determinanti della retina all'interno delle cellule progenitrici sono normalmente espressi in. Questo è esemplificato dal l'esame dei risultati destino di sviluppo dei progenitori che non può più generare proteina funzionale di questi geni ^{4, 6, 8, 9.} Utilizzando questo approccio, abbiamo dimostrato che i fattori determinanti molti Fate (ad esempio, Vsx1, Atoh7, PTF1A, Barhl2) agiscono cellule-autonomously guidare specifici sorti neuronali della retina; la mancanza di espressione genica comporta principalmente un interruttore destino, tale che le cellule con silenziamento genico rimangono vitali adottando un destino alternativo cella ^{4, 6, 7, 10.} In secondo luogo, tali esperimenti chimerici possono essere utilizzati per valutare come selvaggio di tipo progenitori si comportano quando si sviluppano all'interno di diversi ambienti genetici. Ad esempio, confrontando lo sviluppo di cellule WT che normalmente esprimono un gene di interesse (e giornalista transgene) in un WT rispetto ambiente host manipolato (ad esempio, gene knockout / knockdown), gli effetti derivanti sull'espressione genica e destino cellulare possono essere valutati . La mancanza di alcuni tipi di neuroni in ambiente host, ad esempio, è stato dimostrato di influenzare wild type comportamento progenitore in maniera cellule non autonomo, per sollecitare loro verso differenziazione nel o sottorappresentatir mancante tipi di neuroni ^{4, 7, 11, 12.} Dato che i neuroni della retina sono nati in un ordine histogenic conservata dalla fasatura sequenziale espressione di specifici geni destino determinanti neuronali (destino espressione genica) (rivisto in ^13), abbiamo utilizzato questi metodi per dimostrare come la tempistica di espressione genica destino in progenitori di tipo selvatico è influenzato quando tali progenitori si sviluppano in ambienti host della retina con composizioni cellulari aberranti indotte. Qui, descriviamo questi approcci come prova di come la combinazione di tecniche relativamente standard e ampiamente utilizzati consente l'esame della tempistica di espressione genica destino nello sviluppo di progenitori retinici ^{8, 9.}

Questo protocollo descrive un approccio sperimentale che combina l'imaging time-lapse con la facilità di ogniformando il trapianto nella ex vivo in via di sviluppo dell'embrione zebrafish per seguire mosaically individuale cellule marcate durante l'intero periodo di retinogenesi sviluppo. Eseguendo manipolazioni genetiche funzionali sia nell'embrione di accoglienza, embrione donatore, entrambi o nessuno, si può valutare l'autonomia delle cellule della funzione del gene. Questo approccio può essere adattato ampiamente domande di ricerca simili a qualsiasi altro sistema per cui i singoli componenti descritti qui sono adatti.