In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo's to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

De mogelijkheid om belangrijke ontwikkelingsprocessen in een in vivo vertebrate visualiseren heeft bijgedragen dat de zebravis een belangrijk model voor de studie van normale en zieke omstandigheden (besproken in ^{1, 2).} Vooral de neurale retina is een toegankelijk deel van het centrale zenuwstelsel. Het netvlies leent zich gemakkelijk studies van neurogenese voeren vanwege de goed georganiseerde, maar relatief eenvoudige structuur en zijn sterk geconserveerd neuron types in gewervelde species ^3. Dynamiek van cellulaire gedrag zoals proliferatie, celcyclus exit asymmetrische celdeling, het lot specificatie, differentiatie en neurale vorming circuits kan het gehele proces van retinogenesis, die de centrale retina van de zebravis wordt aangevuld met 3 d postfertilization volgen ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Bovendien kan de functionele eisen van verschillende genen in elk van de bovengenoemde stappen gelijktijdig worden beoordeeld in de zebravis netvlies, waardoor een voordeel boven andere vertebraat modellen waarin fenotypen uit de toepassing van gen knockout technieken kunnen alleen worden beoordeeld na autopsie van gefixeerde weefsels. Met name het gebruik van transgene lijnen waarin we visualiseren en controleren de expressie van fluorescerende eiwitten reporter transgenen in de retina, kunnen we tijdresolutie van genexpressie die het ontstaan ​​van een bepaald celtype neuronale grondslag verkrijgen. Door de snelle ontwikkeling van de zebravis, kunnen deze gebeurtenissen worden gevisualiseerd gedurende de gehele ontwikkelingsperiode, waardoor diepere inzichten in de temporele belang van genexpressie ten opzichte van neuronale cellen identiteitsverwerving en celgedrag.

Tenslotte kunnen deze benaderingen efficiënt gecombineerd in de zebravis met de productie van chimeer via transplantaties, waardoor inzicht in twee belangrijke aspecten van genfunctie. Ten eerste behandeling getransplanteerd van een donor embryo, waarin een bepaald gen werd neergeslagen terwijl zij ontwikkelen een ongelabeld wildtype milieu, kunnen we relevante informaties genfunctie in een cel-autonome wijze te verkrijgen. Dit leidt tot belangrijke inzichten over de functie van retinale lot bepalende factoren binnen de progenitorcellen zij worden doorgaans uitgedrukt in. Een voorbeeld hiervan is het onderzoek van de ontwikkeling lot resultaat van voorlopers die niet meer functioneel eiwit te genereren van deze genen ^{4, 6, 8, 9.} Met behulp van deze aanpak, hebben we laten zien dat veel lot bepalende factoren (bijvoorbeeld Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) handelen cel-autonomously specifieke retinale neuronale lot te rijden; het ontbreken van genexpressie voornamelijk leidt tot een lot schakelaar, zodat de cellen met gen knockdown levensvatbare door eerst een alternatieve lot van de cel ^{4, 6, 7, 10} blijven. In de tweede plaats kan een dergelijke chimerische experimenten worden gebruikt om te beoordelen hoe wild type voorouders gedragen wanneer ze binnen de verschillende genetische omgevingen te ontwikkelen. Bijvoorbeeld door vergelijking van de ontwikkeling van WT cellen die gewoonlijk een gen van belang (en reporter transgen) in WT versus gemanipuleerde nieuwe omgeving (bijvoorbeeld gen knockout / knockdown) tot expressie, de daaruit voortvloeiende effecten op genexpressie en lot van de cel kan worden beoordeeld . Het ontbreken van bepaalde neuronen in de nieuwe omgeving, bijvoorbeeld, is aangetoond dat wild type voorlopercellen te beïnvloeden in een cel non-autonome wijze, om vertekening hen naar differentiatie in de ondervertegenwoordigd or ontbrekende neuron typen ^{4, 7, 11, 12.} Gezien het feit dat het netvlies neuronen worden geboren in een geconserveerd histogenic bestelling door de opeenvolgend getimede expressie van specifieke neuronale lot determinant genen (lot genexpressie) (beoordeeld in ^13), gebruikten we deze methoden om aan te tonen hoe de timing van het lot genexpressie in wild type voorlopers wordt beïnvloed wanneer dergelijke voorlopers ontwikkelen retinale hostomgevingen met geïnduceerde afwijkende cellulaire composities. Hier schetsen we deze benaderingen als bewijs voor hoe de combinatie van relatief standaard en meest gebruikte technieken maakt het onderzoek naar de timing van het lot genexpressie in de ontwikkeling van het netvlies voorouders ^{8, 9.}

Dit protocol beschrijft een experimentele benadering combineren time-lapse imaging met het gemak van perhet vormen van transplantatie in de ex vivo ontwikkeling van de zebravis embryo individuele mosaically volgen gelabelde cellen gedurende de gehele periode van ontwikkelings retinogenesis. Door het uitvoeren van functionele gen manipulaties, hetzij in de gastheer embryo, donor embryo, beide of geen van beide, kan men de cel autonomie van gen-functie te beoordelen. Deze benadering kan wijd aangepast soortgelijke vraagstellingen in andere systemen waarvoor de afzonderlijke componenten hier beschreven geschikt.