Análise de uma única partícula de alta resolução a partir de imagens de crio-microscopia de elétrons usando SPHIRE
Summary
Este artigo apresenta um protocolo para processamento de imagens cryo-EM usando o software suite SPHIRE. O presente protocolo pode ser aplicado para quase todos os projetos de EM de partículas individuais que visam a resolução quase atômica.
Abstract
SPHIRE (SPARX para Microscopia Eletrônica de Alta Resolução) é uma nova suíte de software open-source, user-friendly para o processamento semi-automático de dados de crio-microscopia eletrônica de partícula única (cryo-EM). O protocolo aqui apresentado descreve em pormenor como obter uma estrutura de resolução quase atómica a partir de filmes de micrografia crio-EM guiando os utilizadores através de todas as etapas do pipeline de determinação de estrutura de partícula única. Essas etapas são controladas a partir da nova interface gráfica SPHIRE e requerem uma intervenção mínima do usuário. Utilizando este protocolo, uma estrutura de 3,5 � de TcdA1, um complexo de toxina Tc de Photorhabdus luminescens , foi derivada de apenas 9500 part�ulas isoladas. Essa abordagem simplificada ajudará os usuários novatos sem experiência extensiva de processamento e informações estruturais a priori , para obter modelos atômicos isentos de ruído e isentos de seus complexos macromoleculares purificados em seu estado nativo.
Introduction
Após o desenvolvimento da tecnologia de detector de elétrons diretos, o notável progresso no crio-EM de partículas únicas está atualmente reformulando a biologia estrutural 1 . Comparada com a cristalografia de raios X, esta técnica requer apenas uma pequena quantidade de material proteico sem a necessidade de cristalização, ao mesmo tempo que apresenta menos restrições quanto à pureza da amostra e ainda permite a determinação de estruturas com uma resolução quase atómica. Importantemente, composições ou estados diferentes podem agora ser separados computacionalmente e a determinação da estrutura das diferentes conformações pode ser realizada num nível de detalhe sem precedentes. Recentemente, mapas de densidade de moléculas desafiadoras podem ser produzidos em resoluções que permitam a construção de modelos de novo e, portanto, uma compreensão profunda de seu modo de ação 2 , 3 , 4 , 5.
Uma grande variedade de pacotes de software de processamento de imagem estão disponíveis na comunidade 3DEM (3D Electron Microscopy) (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) ea maioria deles está em desenvolvimento contínuo. Foi conseguida uma resolução quase atómica para proteínas que exibem vários pesos moleculares e simetrias com vários pacotes de software diferentes, incluindo EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 e SPARX 11 . Cada pacote requer um nível diferente de experiência do usuário e fornece um nível diferente de orientação do usuário, automação e extensibilidade. Além disso, enquanto alguns programas fornecem ambientes completos para facilitar todas as etapas de análise de imagem, outros são projetados para otimizar tarefas específicas, como o refinamento de parâmetros de alinhamento a partir de um rEstrutura de referência. Mais recentemente, várias plataformas foram desenvolvidas, incluindo APPION 12 e SCIPION 13 , que fornecem um único pipeline de processamento que integra abordagens e protocolos dos diferentes pacotes de software listados acima.
Para contribuir com o desenvolvimento atual de cryo-EM, a SPARX foi re-desenvolvida em uma nova plataforma autônoma e completa para análise de partículas únicas, chamada SPHIRE (SPARX para Microscopia Eletrônica de Alta Resolução). A fim de aumentar a acessibilidade da técnica para os novos pesquisadores no campo e lidar com a grande quantidade de dados produzidos por modernos modernos microscópios eletrônicos high-end, a linha de processamento foi redesenhado e simplificado através da introdução de um fácil de usar Interface Gráfica do Usuário (GUI) e automatizando as principais etapas do fluxo de trabalho. Além disso, novos algoritmos foram adicionados para permitir a determinação rápida, reproduzível e automatizada da estrutura de crImagens yo-EM. Além disso, a validação por reprodutibilidade foi introduzida para evitar artefatos comuns produzidos durante a análise de refinamento e heterogeneidade.
Embora o programa tenha sido amplamente modificado, suas características principais apreciadas foram mantidas: código open-source direto, o moderno design orientado a objetos e interfaces Python para todas as funções básicas. Assim, ele não foi alterado em um programa de caixa preta, permitindo aos usuários estudar e modificar facilmente o código Python, criar aplicativos adicionais ou modificar o fluxo de trabalho geral. Isso é especialmente útil para projetos não-padrão cryo-EM.
Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de um mapa de densidade de resolução quase atômica a partir de imagens cryo-EM usando a GUI de SPHIRE. Ele descreve detalhadamente todas as etapas necessárias para gerar um mapa de densidade a partir de filmes criados diretos cryo-EM de detector direto e não está restrito a qualquer tipo particular de macromolécula. Este protocolo pretende principalmente orientar newcOmers no campo através do fluxo de trabalho e fornecem informações importantes sobre etapas cruciais do processamento, bem como algumas das possíveis armadilhas e obstáculos. As características mais avançadas e o fundo teórico atrás de SPHIRE serão descritos em outra parte.
Protocol
Representative Results
Discussion
O crio-EM de partícula única mostrou um rápido desenvolvimento nos últimos anos e forneceu numerosas estruturas de resolução atômica de complexos macromoleculares de maior significância biológica 25 . Para dar suporte ao grande número de usuários principiantes que atualmente estão entrando no campo, desenvolvemos a plataforma de análise de imagens de partículas únicas SPHIRE e apresentamos aqui um protocolo direto para todo o workflow, incluindo alinhamento de filmes, picking de partículas, estimativa CTF, modelo inicial Cálculo, análise de heterogeneidade 2D e 3D, refinamento 3D de alta resolução e estimativa e filtragem de resolução local.
O protocolo aqui descrito pretende ser um breve guia para a determinação da estrutura 3D utilizando micrografias crio-EM da proteína de interesse e com a ajuda de ferramentas computacionais fornecidas pela GUI autónoma de SPHIRE.
A principal característica do fluxo de trabalho é que a maioriaDos procedimentos precisam ser executados apenas uma vez, uma vez que se baseiam no conceito de validação por reprodutibilidade 19 e não necessitam de ajuste de parâmetros. Este mecanismo de validação automática é uma vantagem principal do SPHIRE sobre outros pacotes de software, uma vez que os resultados tendem a ser objectivos, bem como reprodutíveis e, o mais importante, obtidos a um custo computacional aceitável. O pipeline fornece além disso uma riqueza de informações de diagnóstico para usuários experientes para realizar validação e avaliação independente com métodos próprios. No entanto, um usuário iniciante que tenha, pelo menos, conhecimentos teóricos elementares em biologia estrutural e microscopia eletrônica, deve ser capaz de obter estruturas de resolução atômica usando dados próprios e os procedimentos automatizados de validação.
No entanto, a obtenção de uma estrutura de resolução quase atômica nem sempre é direta eo resultado dependerá muito da qualidade da amostra e da entradauma. Para os procedimentos aqui apresentados, presume-se que existe um número suficiente de filmes EM não alinhados de alta qualidade de alta qualidade, com as suas médias mostrando claramente partículas homogéneas e orientadas aleatoriamente. Em geral, não há restrições quanto à simetria, tamanho ou forma geral da molécula, mas um baixo peso molecular pode ser um fator limitante, especialmente quando a proteína tem uma forma globular sem traços. Normalmente, a análise de partículas maiores, bem ordenadas, com simetria de grupos pontuais elevados é menos exigente. Portanto, é altamente recomendável que usuários iniciantes executem o protocolo presente primeiro com um conjunto de dados crio-EM bem caracterizado. Os dados do tutorial SPHIRE (http: /sphire.mpg.de) ou um dos conjuntos de dados enviados pelo EMPIAR (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) com filmes crus são um bom ponto de partida .
Ao processar dados próprios, é muito provável que alguns conjuntos de dados ou algumas das imagens não satisfaçam certos requisitosCritérios de elegibilidade. Neste contexto, além das verificações automatizadas de estabilidade e reprodutibilidade, realizadas pelo programa para as principais etapas do fluxo de trabalho, ainda é recomendável aos usuários inspecionar visualmente os resultados em certos "pontos de verificação" do protocolo, especialmente se a reconstrução final Não é satisfatória.
A primeira inspeção visual pode ser feita no nível micrográfico após o alinhamento do filme ( etapa 2 do protocolo) e a estimativa do CTF ( etapa 3 do protocolo). As médias de movimento corrigidas resultantes devem mostrar partículas claramente discerníveis e bem separadas e seus espectros de potência devem mostrar anéis de Thon claramente visíveis e isotrópicos. A frequência espacial para a qual são visíveis define, na maioria dos casos, a maior resolução para a qual a estrutura pode, em princípio, ser determinada em última instância. Exemplos de uma média corrigida de movimento de qualidade suficiente e seu espectro de potência são mostrados na seção & #34. Resultados representativos "As imagens que podem ter um impacto negativo no resultado final podem ser removidas com a ajuda das ferramentas GUI de Drift e CTF da SPHIRE (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).
No que diz respeito à triagem de partículas, o passo crucial no pipeline SPHIRE é a classificação 2D usando o ISAC ( passo 5.2 do protocolo ) . Aqui, o utilizador deve controlar que as médias de classe 2D reprodutíveis identificadas automaticamente pelo programa adoptem uma gama de orientações suficientes para cobrir quase uniformemente o espaço angular. Se a qualidade das médias de classe não for satisfatória (imagens barulhentas e / ou embaçadas) e / ou o número de médias de classes reprodutíveis for muito baixo, considere melhorar a qualidade de picking automático, otimizando a geração de imagens ou a preparação da amostra. Na maioria dos casos, não é possível calcular uma reconstrução confiável a partir de um conjunto de dados que não gere boas médias de classes 2D. Exemplos de classe 2D de alta qualidade aveSão apresentadas na secção "Resultados representativos".
Pelo menos 100 médias de classe são necessárias para obter um modelo 3D confiável inicial usando RVIPER de forma automatizada (Protocolo passo 6.1 ). Para esta etapa, o usuário deve selecionar as médias com a mais alta qualidade e incluir tantas orientações diferentes quanto possível da partícula. A qualidade do modelo inicial é fundamental para o sucesso do subsequente refinamento 3D de alta resolução.
Em outros pacotes de software, a classificação 3D às vezes é realizada para remover partículas "ruins" 8 , 9 . No entanto, em SPHIRE a maioria dessas partículas são automaticamente eliminadas já durante a classificação 2D usando ISAC. Assim, recomenda-se executar o passo computacionalmente intensivo da ordenação 3D somente se a reconstrução ea análise de variabilidade 3D indicarem heterogeneidade do conjunto de dados.
O mais importante é que o usuário deve sempre inspecionar cuidadosamente os volumes 3D resultantes cuidadosamente ( etapa 9.3 do protocolo) e confirmar que as características da respectiva densidade concordam bem com a resolução nominal. Com uma resolução <9 Å, as densidades semelhantes a vara correspondentes às hélices-a tornam-se visíveis. Com uma resolução <4,5 Å, as densidades correspondentes às cadeias nas folhas ß são normalmente bem separadas e os aminoácidos volumosos tornam-se visíveis. Um mapa de alta resolução (<3 Å) deve mostrar claramente discernível cadeias laterais, permitindo assim a construção de um modelo atômico preciso.
Os resultados obtidos até à data demonstram que, com a ajuda dos testes automatizados de reprodutibilidade do SPHIRE e de inspeções visuais mínimas, o presente protocolo é geralmente aplicável a qualquer tipo de projeto de crio-EM de partículas únicas. Resultados representativos de cada passo de processamento são mostrados para a reconstrução da toxina TcdA1 dePhotorhabdus luminescens 21 , que foi resolvido para resolução quase atômica. Mapas de densidade de qualidade semelhante podem ser usados para construir modelos atômicos confiáveis por traçado de novo backbone, bem como recíproco ou real-espaço refinamento e, assim, fornecer uma estrutura sólida estrutura para a compreensão dos mecanismos moleculares complexos.
CÓDIGOS DE ACESSO:
As coordenadas da estrutura EM e os filmes não processados foram depositados no Banco de Dados de Microscopia Electrónica e no Arquivo de Imagem Piloto de Microscopia Electrónica com os números de acesso EMD-3645 e EMPIAR-10089, respectivamente.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a D. Roderer por nos fornecer TcdA1 micrografias. Agradecemos a Steve Ludtke pelo seu apoio contínuo à infra-estrutura EMAN2. Este trabalho foi apoiado por fundos da Sociedade Max Planck (SR) e do Conselho Europeu no âmbito do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7 / 2007-2013) (subvenção n.º 615984) e subvenções dos Institutos Nacionais de Health R01 GM60635 para PAP).
Materials
| SPHIRE | Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund and Houston Medical School, Houston, Texas | http://sphire.mpg.de | |
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Unblur | Janelia Farm Research Campus, Ashburn | http://grigoriefflab.janelia.org/unblur | |
| Coot | MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge | http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
| EMAN2 | Baylor College of Medicine, Houston | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | |
| Computing Cluster with 1824 cores | Max Planck Institute of Molecular Physiology | Linux Cluster with 76 nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM | |
| TITAN KRIOS electron microscope | FEI | 300 kV, Cs correction, XFEG | |
| Falcon II direct electron detector | FEI | ||
| EPU (automated data acquisition software) | FEI | https://www.fei.com/software/epu/ |
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