SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi
Summary
Bu makale SPHIRE yazılım paketini kullanarak cryo-EM görüntüleri işlemek için bir protokol sunmaktadır. Mevcut protokol, neredeyse atomik çözünürlüğü hedefleyen hemen hemen tüm tek parçacılı EM projeleri için uygulanabilir.
Abstract
SPHIRE (Yüksek Çözünürlüklü Elektron Mikroskopisi için SPARX), tek parçacıklı elektron cryo-mikroskopi (cryo-EM) verilerinin yarı otomatik olarak işlenmesi için yeni ve açık kaynaklı, kullanıcı dostu bir yazılım paketidir. Burada sunulan protokol, kullanıcıları tek parçacıklı yapı tayini boru hattının tüm adımları boyunca yönlendirerek, cryo-EM mikrograf filmlerinden başlayarak atom-altı bir çözünürlük yapısının nasıl elde edilebileceğini ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu adımlar, yeni SPHIRE grafik kullanıcı arayüzünden kontrol edilir ve minimum kullanıcı müdahalesi gerektirir. Bu protokolü kullanarak, Photorhabdus luminescens'den bir Tc toksin kompleksi olan 3.5Å yapıdaki TcdA1 , yalnızca 9500 tek parçacıktan türetilmiştir. Bu aerodinamik yaklaşım, acil makromoleküler komplekslerinin doğal hallerinde gürültülü ve tarafsız atomik modeller elde etmeleri için, kapsamlı bir işleme deneyimi olmayan acemi kullanıcılara ve önceden yapılmış bir yapısal bilgiye yardımcı olacaktır.
Introduction
Doğrudan elektron dedektörü teknolojisinin gelişmesinden sonra, tek parçacık kriyo-EM'deki dikkate değer ilerleme şu anda yapısal biyolojiyi yeniden şekillendirmektedir 1 . X-ışını kristalografisi ile karşılaştırıldığında, bu teknik, kristalizasyona gerek duymadan az miktarda protein materyali gerektirirken, aynı zamanda numunenin saflığı konusunda daha az kısıtlama getirmekte ve yine atomik çözünürlük yakınında yapıların belirlenmesine izin vermektedir. Önemlisi, şimdi farklı kompozisyonlar veya durumlar hesaplanabilir bir şekilde ayrılabilir ve farklı konformasyonların yapı belirlenmesi eşi benzeri görülmemiş detay seviyesinde yapılabilir. Son zamanlarda, zorlayıcı moleküllerin yoğunluk haritaları, de novo model yapımına izin veren çözünürlüklerde üretilebilir ve bu nedenle bunların hareket tarzlarının derin bir şekilde anlaşılması 2 , 3 , 4 , 5.
3DEM (3D Elektron Mikroskopisi) topluluğunda (https://tr.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) çok çeşitli görüntü işleme yazılım paketleri mevcuttur ve bunların çoğu sürekli geliştirilmektedir. EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 ve SPARX 11 gibi çeşitli yazılım paketleri ile çeşitli molekül ağırlığı ve simetrileri sergileyen proteinler için yaklaşık atom özünürlüğü elde edilmiştir. Her pakette kullanıcı uzmanlığının farklı bir seviyesi gerekiyor ve farklı düzeylerde kullanıcı kılavuzu, otomasyon ve genişletilebilirlik sağlıyor. Ayrıca, bazı programlar görüntü analizinin tüm adımlarını kolaylaştırmak için eksiksiz ortamlar sağlarken, bazıları bilinen r'den başlayarak hizalama parametrelerinin arıtılması gibi belirli görevleri optimize etmek üzere tasarlanmıştır.Eferans yapısı. Daha yakın tarihte, yukarıda listelenen farklı yazılım paketlerinden gelen yaklaşımları ve protokolleri birleştiren tek bir işleme hattı sağlayan APPION 12 ve SCIPION 13 dahil olmak üzere çeşitli platformlar geliştirildi.
Mevcut cryo-EM gelişimine katkıda bulunmak için SPARX, SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) adı verilen tek parçacık analizi için yeni ve bağımsız bir platform haline getirildi. Teknolojinin bu alandaki yeni araştırmacılar için erişilebilirliğini arttırmak ve modern tümüyle otomatikleştirilmiş üst düzey elektron mikroskopları tarafından üretilen büyük miktardaki verilere uyum sağlamak için, işleme hattı, kullanımı kolay bir tanıtılarak yeniden tasarlandı ve basitleştirildi Grafik Kullanıcı Arayüzü (GUI) ve iş akışının ana adımlarını otomatikleştirmek. Ayrıca, cr'den hızlı, tekrarlanabilir ve otomatik yapının belirlenmesine izin vermek için yeni algoritmalar eklenmiştir.Yo-EM görüntüleri. Ayrıca, arıtılma ve heterojenite analizi sırasında üretilen ortak eserlerden kaçınmak için tekrarlanabilirlik ile geçerlilik kazandırılmıştır.
Program kapsamlı bir şekilde değiştirilmesine rağmen, takdir edilen çekirdek özellikleri korunmuştur: basit açık kaynak kod, modern nesne yönelimli tasarım ve tüm temel fonksiyonlar için Python arayüzleri. Böylece, kullanıcıların Python kodunu inceleyip kolayca değiştirebilmelerini, ek uygulamalar yaratmalarını veya genel iş akışını değiştirmelerini sağlayan bir kara kutu programı olarak değiştirilmedi. Bu, standart olmayan cryo-EM projeleri için özellikle yararlıdır.
Burada, SPHIRE'nin GUI'sini kullanarak cryo-EM görüntülerinden atom-altı bir çözünürlük yoğunluğu haritası elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Çiğ cryo-EM direkt dedektör filmlerinden yoğunluk haritası oluşturmak için gereken tüm aşamaları ayrıntılı olarak açıklar ve herhangi bir makromolekül tipi ile sınırlı değildir. Bu protokol esas olarak newc'yiIş akışıyla sahaya çıkıyor ve işlemenin önemli adımlarının yanı sıra olası tuzaklar ve engeller hakkında önemli bilgiler sağlıyor. Daha gelişmiş özellikler ve SPHIRE'nin arkasındaki teorik arka plan başka yerlerde açıklanacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tek parçacıklı cryo-EM, son yıllarda hızlı bir gelişme göstermiş ve büyük biyolojik önemi olan makromoleküler komplekslerin sayısız atomik çözünürlük yapıları üretmiştir25. Şu anda sahaya giren çok sayıda acemi kullanıcısını desteklemek için tek parçacıklı görüntü analiz platformu SPHIRE'yi geliştirdik ve burada film hizalama, parçacık toplama, CTF tahmini, başlangıç modeli dahil olmak üzere tüm iş akışları için bir walk-through protokolü sunduk Hesaplama, 2D ve 3D heterojenite analizi, yüksek çözünürlüklü 3D iyileştirme ve yerel çözünürlük tahmini ve filtreleme.
Burada açıklanan protokol, ilgilenilen proteinin cryo-EM mikrograflarını kullanarak ve SPHIRE'nin tek başına GUI tarafından sağlanan hesaplama araçlarının yardımıyla, 3B yapı tayini için kısa bir rehber olarak tasarlanmıştır.
İş akışının en önemli özelliği,Prosedürlerin tekrarlanabilirlik 19 ile geçerlilik kavramına dayandığı ve parametre ayarlamasına ihtiyaç duymadığı için yalnızca bir kez çalıştırılması gerekir. Bu otomatik validasyon mekanizması, SPHERE'nin diğer yazılım paketlerine kıyasla önemli bir avantajıdır; çünkü sonuçlar, nesnel olabilmeleri ve çoğaltılabilir olmaları ve daha da önemlisi, kabul edilebilir bir hesaplama maliyetiyle elde edilebilir olma eğilimindedirler. Boru hattı ayrıca deneyimli kullanıcılar için kendi yöntemleriyle bağımsız bağımsız doğrulama ve değerlendirme yapmak için zengin bir teşhis bilgisi sağlar. Yine de, yapısal biyoloji ve elektron mikroskobunda en azından temel teorik altyapıya sahip olan bir acemi kullanıcı, kendi verileri ve otomatik validasyon prosedürleri kullanarak atom-altı çözünürlük yapıları elde edebilmelidir.
Bununla birlikte, atom-altı bir çözünürlük yapısının elde edilmesi her zaman açık değildir ve sonuç, numunenin kalitesine ve giriş verilerine bağlıdıra. Burada sunulan prosedürler için, yeterli sayıda homojen ve rastgele yönlendirilmiş tek parçacıklar gösteren ortalama yüksek kaliteli, hizalanmamış ham EM filmleri bulunduğunu varsaymaktadır. Genel olarak, simetri, boyut veya molekülün genel şekli ile ilgili herhangi bir kısıtlama yoktur, ancak düşük moleküler ağırlık, özellikle protein şekilsiz küresel şekle sahip olduğunda, sınırlayıcı bir faktör olabilir. Genellikle, yüksek nokta grubu simetrisi ile daha büyük, iyi düzenlenmiş parçacıkların analizi daha az talep gerektirir. Bu nedenle acemi kullanıcıların mevcut protokolü önce iyi karakterize edilmiş bir cryo-EM veri setiyle çalıştırmaları kesinlikle önerilir. Ya SPHIRE öğretici veriler (http: /sphire.mpg.de) veya ham filmlerle EMPIAR tarafından sunulan veri kümelerinden (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) biri iyi bir başlangıç noktasıdır .
Kendi verilerinizi işlerken, bazı veri kümelerinin veya bazı resimlerin bazı quali'yi karşılamayacağı muhtemeldirKriterleri. Bu bağlamda, iş akışının büyük adımları için program tarafından gerçekleştirilen otomatik kararlılık ve tekrarlanabilirlik kontrollerine ek olarak, kullanıcıların protokolün belirli "kontrol noktalarında" sonuçlarını görsel olarak incelemesi önerilir, özellikle de son yeniden yapılanma Tatmin edici değil.
İlk görsel muayene, film hizalamasından ( Protokol adımı 2 ) ve CTF tahmini sonrasında ( protokol adım 3 ) mikrograf düzleminde yapılabilir. Ortaya çıkan hareket düzeltilmiş ortalamalar açıkça ayırt edilebilir ve iyi ayrılmış tek parçacıklar göstermeli ve güç tayfları açıkça görülebilir, izotropik Thon halkaları göstermelidir. Görünür oldukları mekansal frekans, çoğu durumda, yapının ilke olarak nihai olarak belirleyebileceği en yüksek çözünürlüğü tanımlar. Hareket düzeltilmiş yeterli kalitede ve güç tayfı ortalamasına örnekler,34; Temsilcilik Sonuçları "Son sonuca olumsuz etkisi olabilecek outlier görüntüler, SPHIRE'nin Drift ve CTF değerlendirme GUI araçlarıyla (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php) kaldırılabilir.
Parçacık taramasıyla ilgili olarak, SPHIRE boru hattındaki önemli adım, ISAC'yi kullanarak 2D sınıflandırmadır ( Protokol Adımı 5.2) . Burada, kullanıcı, program tarafından otomatik olarak tanımlanan yeniden üretilebilir 2D sınıf ortalamalarının, açısal alanı tamamen eşit şekilde örtmek için yeterli bir oryantasyon aralığını benimsemesini kontrol etmelidir. Sınıf ortalamaları kalitesi tatmin edici değilse (gürültülü ve / veya bulanık görüntüler) ve / veya tekrarlanabilir sınıf ortalamaları çok düşükse, otomatik toplama kalitesini iyileştirmeyi, veri kümesi görüntülemeyi veya örnek hazırlamayı optimize etmeyi düşünün. Çoğu durumda, iyi bir 2D sınıf ortalamaları sağlamayan bir veri kümesinden güvenilir bir yeniden yapılandırma hesaplamak mümkün değildir. Yüksek kaliteli 2D sınıf ave örnekleri"Temsilci Sonuçlar" bölümünde gösterilmektedir.
RVIPER kullanarak otomatik bir şekilde güvenilir bir başlangıç 3D modeli elde etmek için en az 100 sınıf ortalaması gereklidir ( Protokol Adımı 6.1 ). Bu adım için, kullanıcı en yüksek kalitede ortalamaları seçmeli ve parçacığın mümkün olduğunca çok yönünü içermelidir. İlk modelin kalitesi, sonraki yüksek çözünürlüklü 3D iyileştirmenin başarısı için kritik önem taşıyor.
Diğer yazılım paketlerinde, "kötü" parçacıkları 8 , 9 kaldırmak için bazen 3D sınıflandırma yapılır. Bununla birlikte, SPHIRE'de bu parçacıkların çoğu, ISAC kullanılarak 2D sınıflandırma sırasında otomatik olarak elimine edilir. Bu nedenle, 3D sıralama işleminin yoğun bir adımını gerçekleştirmek için yeniden yapılandırma ve 3D değişkenlik analizi, veri kümesinin heterojenliğini gösteriyorsa önerilir.
En önemlisi, kullanıcı her zaman ortaya çıkan 3B birimlerini dikkatli bir şekilde dikkatlice kontrol etmeli ( Protokol adımı 9.3 ) ve ilgili yoğunluğun özelliklerinin nominal çözünürlük ile iyi uyduğunu onaylamalıdır. <9Å çözünürlüğünde, α-helislere karşılık gelen çubuk benzeri yoğunluklar görülebilir hale gelir. <4.5 Å çözünürlükte, β-tabakalarındaki ipliklere karşılık gelen yoğunluklar normalde iyi ayrılır ve hacimli amino asitler görünür hale gelir. Yüksek çözünürlüklü bir harita (<3 Å) açıkça görülebilir yan zincirler göstermeli ve böylece doğru bir atom modelinin oluşturulmasına izin verilmelidir.
Bugüne kadar elde edilen sonuçlar, SPHERE'nin otomatik tekrarlanabilirlik testleri ve minimal görsel incelemelerin yardımıyla, mevcut protokolün her türden tek parçacıklı cryo-EM projesine uygulanabileceğini göstermektedir. Her işleme adımının temsili sonuçları, TcdA1 toksininin yeniden yapılandırılması için gösterilir.Photorhabdus luminescens 21 , atomik çözünürlük yakınında çözülmüştür. Benzer nitelikteki yoğunluk haritaları, de novo omurga izlemenin yanı sıra karşılıklı veya gerçek uzay arıtma yöntemiyle güvenilir atom modelleri oluşturmak ve böylece karmaşık moleküler mekanizmaların anlaşılması için sağlam bir yapısal çerçeve sağlamak için kullanılabilir.
ACCESION KODLARI:
EM yapısının ve işlenmemiş filmlerin koordinatları sırasıyla EMD-3645 ve EMPIAR-10089 erişim numaraları altında Elektron Mikroskopisi Veri Bankası'na ve Elektron Mikroskopisi Pilot Görüntü Arşivi'ne yatırıldı.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bize TcdA1 mikrografları sağladığı için D. Roderer'a teşekkür ediyoruz. Steven Ludtke'ye EMAN2 altyapısının devam eden desteği için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Max Planck Topluluğu'ndan (SR'ye) ve Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7 / 2007-2013) (615984 no'lu hibeye kadar) Avrupa Konseyi'ne (SR'ye) ve Ulusal Enstitülerden Sağlık R01 GM60635 ila PAP).
Materials
| SPHIRE | Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund and Houston Medical School, Houston, Texas | http://sphire.mpg.de | |
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Unblur | Janelia Farm Research Campus, Ashburn | http://grigoriefflab.janelia.org/unblur | |
| Coot | MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge | http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
| EMAN2 | Baylor College of Medicine, Houston | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | |
| Computing Cluster with 1824 cores | Max Planck Institute of Molecular Physiology | Linux Cluster with 76 nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM | |
| TITAN KRIOS electron microscope | FEI | 300 kV, Cs correction, XFEG | |
| Falcon II direct electron detector | FEI | ||
| EPU (automated data acquisition software) | FEI | https://www.fei.com/software/epu/ |
References
- Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Bai, X. -. C., Yan, C., et al. An atomic structure of human γ-secretase. Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).
- Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution. Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).
- von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
- Tang, G., Peng, L., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
- Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Scheres, S. H. W. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Shaikh, T. R., Gao, H., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
- Hohn, M., Tang, G., et al. SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing. Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).
- Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment. Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).
- Frank, J. . Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , (2006).
- Woolford, D., Ericksson, G., et al. SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software. Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).
- Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images. Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).
- Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail. Nature Publishing Group. , (2016).
- Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins. Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).
- Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail. Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).
- Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation. Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Callaway, E. The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology. Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).
