Peptid, bir monoklonal antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunun belirlenmesi: Tarama destekli
Summary
Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.
Abstract
bağışıklık sisteminin bir antijenik epitopa tanımlanması aşılar ve peptid ilaçların geliştirilmesi kolaylaştırabilir nötralize edici antikorların bir koruyucu mekanizma anlaşılabilmiştir. Peptid tarama delikanlı monoklonal bir antikor (mAb) tarafından tanınan lineer epitop harita basit ve etkili bir yöntemdir. Burada, yazarlar nötrleştirici mAb kullanılarak sinir nekroz virüsü kaplama proteininin antigenik tanınması için seri kesik rekombinant proteinleri, sentetik peptid tasarımı ve nokta-benek hibridizasyonu ile ilgili bir epitop belirlenmesi yöntemi sunulmaktadır. Bu teknik, bir poliviniliden florür (PVDF) membran üzerinde sentetik peptidler ve mAb'lerin nokta benek hibridizasyonu dayanır. RG-M56 mAb tarafından tanınan bir viral kat proteininin en az antijenik bölge 6-mer peptit epitopu üzerine peptit haritalama kesilmiş adım adım daraltıldığı edilebilir. Buna ek olarak, alanin tarama mutajenezi ve tortu, altikamesi veya epitopu oluşturan her bir amino asit tortusu bağlanması önem karakterize etmek için gerçekleştirilebilir. epitop sitesini kuşatan kalıntıları peptid konformasyon düzenlenmesinde kritik roller oynamaya bulundu. tanımlanan epitop peptit bir X-ışını kırılım çalışmasının ve fonksiyonel rekabet veya tedavi için epitopunun peptid-antikor komplekslerinin kristalleri meydana getirmek üzere kullanılabilir.
Introduction
Bağışıklık sisteminde, V, D ve J segmentlerinin rekombinasyon antikorları patojenik enfeksiyon ana korumak için çeşitli antijenlere bağlanması için tamamlayıcılığı belirleyici bölgelerinde (CDR'ler) muazzam varyasyonlarını oluşturmak için sağlar. antijenlere karşı antikorların nötralize savunma antikorlarının CDR ve antijenlerin epitoplarına arasındaki mekansal tamamlayıcılık bağlıdır. Bu nedenle, bu moleküler etkileşim bir anlayış profilaktik aşı tasarımı ve terapötik peptid ilaç geliştirme yardımcı olacaktır. Bununla birlikte, bu nötrleştirme etkileşimi, tek bir antijen birden fazla antijenik alan ile ve dolayısıyla epitop belirleme süreci daha karmaşık hale antikor çoklu CDR'ler, hem de etkilenebilir. Neyse ki, miyelom hücreleri ile, bireysel antikor üreten hücrelerin sigortalar hibridom teknolojisinin gelişmesi, sn hücrelerin sürekli bölünmesi toplu sağlarBir monoklonal antikor (mAb) olarak bilinen retenin belirli bir antikor, 1. Hibridoma hücreleri, spesifik antijenin tek bir antijenik alana bağlanabilir, bu, saf, yüksek afiniteli mAbs üretir. Kurulan antijen-antikor, peptit taraması dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar arasında bir ilişki ile, karşılık gelen mAb kullanan bir antijenin epitopunun belirlenmesi için kullanılabilir. sentetik peptid teknolojisindeki son gelişmeler peptid tarama tekniği daha erişilebilir ve gerçekleştirmek için daha uygun hale getirmiştir. Kısaca, üst üste binen sentetik peptidlere bir dizi, bir hedef bir antijen dizisine göre üretilir mAb hibridizasyona katı destekli zara ilişkilidir. Peptid tarama bölgesinin antikor bağlanmasını eşlemek için kolay bir yol sunar, ancak, aynı zamanda epitop peptit her AA tortu antikorun CDR arasındaki bağlanma etkileşimini değerlendirmek için tortu, tarama veya ikame arası amino asit (aa) mutagenez kolaylaştırmaktadır.
<p class = "jove_content"> Burada, bu çalışmada, bir nötralize edici mAb 2, 3, 4 ile san bir orfoz sinir nekroz virüsü (YGNNV) kaplama proteininin lineer epitopa etkin tanımlanması için bir protokol açıklamaktadır. Protokol mAb, inşaat ve seri kesik rekombinant proteinlerin ekspresyonu sentetik üstüste binen peptit tasarım, nokta-benek hibridizasyonu, alanin tarama ve ikame mutagenezi bulunmaktadır. Peptit sentezi yüksek maliyeti göz önüne alındığında, seri arzu edilen bir hedef proteini rekombinant proteinleri kesilmesi aşamasının tadil edilmiş, ve sentetik peptid dizisi nokta-blot analizi gerçekleştirilmiştir önce antijenik bölge yaklaşık 100 ila 200 aa artıkları kadar daraltılmıştır.Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, mAb tanınan lineer epitopunu belirlemek için hızlı ve basit bir teknik sunmaktadır. dikkate peptit sentezi ve sentez peptidlerin üretim verimliliği maliyeti alarak, virüs kaplama proteininin antijenik bölgenin peptit tarama analizinden önce seri kesik rekombinant proteinleri ifade azaltılmıştır. 10 ila 50 arasındaki moleküler ağırlıklara sahip bir araya getiren proteinler kDa kolaylıkla bu sistem ile ifade edilebilir Bu nedenle, güvenli ve etkili bir E.coli pET ifade sistemi, b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.
Materials
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E.coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E.coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -. S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A., Liao, I. C., Leaño, E. M. . The Aquaculture of Groupers. , 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
