Пептид Сканирование при содействии идентификации моноклональных антител узнаваемым Линейная B-клеточный эпитоп
Summary
Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.
Abstract
Идентификация антигенный эпитоп иммунной системой позволяет для понимания защитного механизма нейтрализующих антител, которые могут способствовать разработке вакцин и пептидных лекарственных средств. Сканирование Пептид представляет собой простой и эффективный метод, который отображает прямолинейно линейный эпитоп, распознаваемый моноклональным антителом (МАБ). Здесь авторы представляют методологию определения эпитопов с участием последовательно укороченные рекомбинантных белков, синтетический пептид дизайн и дот-блот-гибридизацию для антигенного распознавания нервного вируса некроза белка оболочки, используя нейтрализующий мАт. Этот метод основан на дот-блот-гибридизации синтетических пептидов и моноклональных антител на поливинилиденфторида (PVDF) мембрану. Минимальная антигенную область вирусного белка оболочки, признанной RG-М56 мАт может быть сужен на шаг за шагом отделан пептидный отображение на 6-мерный пептид эпитопа. Кроме того, аланин-сканирующий мутагенез и остаток субзаместительной может быть выполнена, чтобы характеризовать связывающую значимость каждого аминокислотного остатка, составляющих эпитоп. Были найдены остатки, фланкирующие сайт эпитоп играть решающую роль в регуляции пептидный конформации. Указанный эпитоп пептид может быть использован для образования кристаллов эпитипа пептидных-антитело для дифракции исследования рентгеновского и функциональной конкуренции, или для терапии.
Introduction
В иммунной системе, рекомбинация сегментов V, D и J позволяет создавать антитела огромные вариации определяющие комплементарность области (CDR) , для связывания с различными антигенами , чтобы защитить хозяина от патогенных инфекций. Нейтрализатор защита антител против антигенов, зависит от пространственной комплементарности между CDRs антител и эпитопов антигенов. Таким образом, понимание этого молекулярного взаимодействия будет способствовать профилактический дизайн вакцин и терапевтический пептид наркотиков. Тем не менее, это взаимодействие нейтрализация может влиять как несколькими антигенные домены из одного антигена и множественными CDRs антител, которые, следовательно, делает процесс определения эпитопов более сложным. К счастью, развитие гибридомной технологии, которая плавит отдельные антитело-продуцирующих клеток с клетками миеломы, позволяет постоянно делящей партии клеток в сексплетение одно специфическое антитело, известное как моноклональное антитело (монАТ) 1. Клетки гибридомы производят эти чистые, высоким сродством мАт связываться с одного антигенного домена специфического антигена. При соотношении антиген-антитело, установленного несколько подходов, в том числе пептидов сканирования, могут быть использованы для определения эпитопа антигена с использованием его соответствующего мАт. Последние разработки в области синтетической пептидной технологии сделали метод пептидного сканирования более доступной и удобной для выполнения. Если коротко, то множество перекрывающихся синтетических пептидов, получают в соответствии с последовательностью антигена-мишени и связаны с твердой подложке мембраны для монАТ гибридизации. сканирование Пептид не только предлагает простой способ отображения антитела область связывания, но также облегчает аминокислоту (аа) мутагенеза с помощью сканирования остатка или замещения для оценки связывания взаимодействия между каждым аа остатком эпитопа пептида и CDR-антитела.
<p cдеваха = "jove_content"> Здесь, в настоящем исследовании описывается протокол для эффективной идентификации линейного эпитопа белка оболочки желтый группер вирус нервной некроз (YGNNV) с использованием нейтрализующего мАт 2, 3, 4. Протокол включает MAB подготовку, конструкции и экспрессии серийно усеченных рекомбинантных белков, синтетический перекрывающийся дизайн пептид, дот-блот-гибридизацию, сканирование аланин, а также заместительную мутагенеза. Принимая во внимание высокую стоимость синтеза пептидов, стадия последовательно усечения рекомбинантных белков желаемого целевого белка был изменен, и антигенную область была сужена до приблизительно 100 до 200 аминокислотных остатков, прежде чем синтетический пептид массив анализ дот-блот был проведен.Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол предлагает быстрый и простой метод для идентификации МАБ признан линейный эпитоп. Принимая во внимание стоимость пептидного синтеза и эффективности производства синтеза пептидов, антигенный участок белка вируса оболочки был уменьшен путем экспрессии последовательно ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.
Materials
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E.coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E.coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -. S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A., Liao, I. C., Leaño, E. M. . The Aquaculture of Groupers. , 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
