Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

Microscopio ottico, tra cui confocale e microscopia a due fotoni, ha dimostrato di essere uno strumento efficace per studiare in processi neuronali in vivo, tra le altre cose ^{1, 2.} Anche se la risoluzione spaziale tipica a livello (LM) Luce microscopica è di circa 200 nm, i recenti progressi tecnologici utilizzando diverse sorgenti luminose, quali ultravioletti estremi e soft microscopia a raggi X, sono notevolmente aumentate presente risoluzione risoluzione spaziale quasi 10 nm ^{3 , 4, 5.} Altri progressi tecnologici nel campo dell'imaging comprendono combinati risonanza magnetica con istologia e fornire un nuovo metodo per misurare lo spessore della guaina mielinica in vivo, un parametro che era tradizionalmente misurabile solo a livello Microscopio Elettronico (EM) ^{6, 7.} although questi progressi a livello LM forniscono un eccellente strumento per studiare processi viventi, una vista dettagliata e caratterizzazione di strutture, come contatti sinaptici, potrebbero essere ottenuti soltanto con EM, che offre una risoluzione che può raggiungere 0,5 nm. Tuttavia, l'osservazione al livello EM richiede i campioni morto e alterato in qualche modo, con fissativi chimici e processi di disidratazione, al fine di preservare il citoarchitettura. Così, esaminando campioni biologici ad alta risoluzione può essere difficile a causa di danni da radiazione dal fascio di elettroni, basso contrasto, deviazioni strutturali delle membrane, o anche la presenza di artefatti che possono verificarsi in seguito alla disidratazione ed epossidico incorporamento ^{8, 9, 10.}

Conservando campioni nella loro forma nativa per l'analisi strutturale può essere ottenuto utilizzando "Cryo EM di sezioni vetrificati" o CEMOVIS, un approccio che sezionamentocoinvolge rapidamente congelamento e incorporare il campione in ghiaccio vitreo ed esaminando sezioni sotto EM ad una temperatura criogenica ^{11, 12.} Questa procedura permette l'esame di campioni mentre sono ancora solido e completamente idratata, eliminando artefatti causati da disidratazione quindi elabora ^13. Tuttavia, questo metodo richiede dispositivi aggiuntivi per crio-ultramicrotomia, nonché dispositivi aggiuntivi standard EM, al fine di consentire questa osservazione a temperature molto basse, che generano notevoli costi aggiuntivi. Inoltre, l'approccio CEMOVIS preclude l'uso di tecniche immunomarcatura, poiché gli anticorpi solito devono essere incubate a temperatura ambiente. In alternativa, è possibile combinare analisi ultrastrutturale con procedure immunoistochimiche utilizzando un approccio di congelamento-sostituzione, durante il quale i campioni crio-fissa sono lentamente scongelati mentre immerso nella chimica crio-protettivo e sono then incorporato in resine speciali, come ad esempio Lowicryls. Post-embedding immunomarcatura può quindi essere eseguita su tale materiale ^12. Tuttavia, le tecniche di congelamento-sostituzione e crio-fissaggio sono in termini di tempo. Essi richiedono l'installazione di apparecchiature supplementari e richiedono ancora campioni esposti a solvente organico e un agente chimico che può alterare il citoarchitettura, nonostante l'uso di una bassa temperatura ^{14, 15.} Quindi, nonostante tutti i progressi tecnologici sia a livello LM e EM, fissaggio chimico del tessuto cerebrale, in particolare con acroleina, rimane un metodo a basso costo e in tempi rapidi per combinare immunoistochimica con EM ^16.

Negli ultimi decenni, molti tentativi sono stati fatti per trovare una miscela di aldeidi che forniscono la migliore conservazione dei tessuti. Prima di 1960, l'unico agente chimico che ha dato risultati accettabili per EM era tetrossido di osmio. Tuttavia, tetrossido di osmio è altamente tossico e costoso, precludendo il suo utilizzo attraverso il sistema vascolare per riparare organi come il cervello. Acroleina è stato introdotto alla fine del 1950 come un metodo affidabile per la conservazione dei tessuti animali adatto per EM osservazione delle strutture cellulari ^17. Esso penetra il tessuto più profondamente e reagisce più rapidamente rispetto ad altri aldeidi quando utilizzate per il fissaggio mediante immersione e consente una buona conservazione dei componenti citoplasmatici, con minimo ritiro del tessuto ^17. Tale caratteristica conferisce acroleina fissazione un evidente vantaggio rispetto ad altre aldeidi quando usato in tessuto fresco, permettendo una localizzazione più accurata di composti molecolari, come gli enzimi e altre proteine ¹⁸ vivente. Infatti, è stato convalidato attraverso gli anni come un metodo semplice, efficace e di basso costo di fissazione per visualizzazione a livello EM in molte specie, tra anfibi e roditori, come efficientemente stabiliZES peptidi e proteine, mantiene antigenicità e fornisce ultrastruttura relativamente intatto quando usato in combinazione con un altro aldeide fissativo ^{16, 18, 19, 20, 21.} Protocolli per acroleina fissazione in roditori sono da allora stati standardizzati e ampiamente utilizzati, in particolare dal gruppo Pickel, per attuare doppio immunomarcatura per EM ^{16, 22.} Alcuni gruppi hanno usato la fissazione acroleina nel tessuto cerebrale dei primati non umani ^23. Tuttavia, a nostra conoscenza, non v'è un solo protocollo pubblicato che descrive in modo efficiente fissazione chimica con acroleina nei primati non umani che è compatibile con EM immunomarcatura ^24.

In questo articolo, mettiamo a disposizione un metodo semplice e affidabile per risolvere in modo efficiente chimicamente non-humun cervello primati con acroleina, consentendo una conservazione a lungo termine potenzialmente insieme con pre-embedding immunomarcatura e EM trasmissione esame.