הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

במיקרוסקופ אור, כולל confocal מיקרוסקופיה שני פוטונים, הוכיחה להיות כלי יעיל לחקר בתהליכים עצביים vivo, בין היתר ^{1, 2.} למרות הרזולוציה המרחבית הטיפוסית ברמת האור המיקרוסקופית (LM) היא כ 200 ננומטר, התקדמות טכנולוגית אחרונה באמצעות מקורות אור שונים, כגון אולטרה סגול קיצוני וכן במיקרוסקופ רנטגן הרכה, גדל בעיקר החלטה זו החלטה מרחבית 10 ננומטר כמעט ^{3 , 4, 5.} התקדמות טכנולוגית אחרת הדמיה כוללת בשילוב הדמיה בתהודה מגנטית עם היסטולוגיה ולספק שיטה חדשה למדידת העובי של מעטפת המיאלין in vivo, פרמטר זה היה למדידה באופן מסורתי רק על מיקרוסקופית אלקטרונים (EM) הרמה ^{6, 7.} AlthouGH התקדמויות אלה ברמת LM לספק כלי מצוין ללימוד תהליכי חיים, נוף ואפיון מפורט של מבנים, כגון קשרים סינפטיים, יכול להיות מושגת רק עם EM, המציע רזולוציה שיכול להגיע 0.5 ננומטר. עם זאת, תצפית ברמת EM מחייבת דגימות להיות מת ושינה במובנים מסוימים, עם fixatives כימי ותהליכי התייבשות, על מנת לשמר את cytoarchitecture. לפיכך, בחינת דגימות ביולוגיות ברזולוציה גבוהה יכול להיות מאתגרת בשל נזקי קרינה מקרן האלקטרונים, ניגודיות נמוכה, סטיות מבניות של ממברנות, או אפילו נוכחות של חפצים שיכולים להתרחש התייבשות אפוקסי הבאים הטבעה ^{8, 9, 10.}

שימור דגימות בצורתם המקורית לניתוח מבני יכול להיות מושגת על ידי שימוש "Cryo EM סעיפים מזוגגים" או CEMOVIS, גישת חתך כיכרוך מקפיא והטבעה המדגם במהירות קרח זגוגי בחינת הסעיפים תחת EM בטמפרטורה קריוגני ^{11, 12.} הליך זה מאפשר בחינת דגימות בזמן שהם עדיין מוצקים hydrated מלא, ובכך לחסל חפצים הנגרמים על ידי התייבשות מעבד ^13. עם זאת, שיטה זו כרוכה מכשירים נוספים קריו-ultramicrotomy, כמו גם מכשירים נוספים על EM הרגיל, על מנת לאפשר תצפית זו בטמפרטורות מאוד נמוכות, אשר יוצרות עלויות משמעותיות נוספות. בנוסף, הגישה CEMOVIS מונע את השימוש של immunolabeling טכניקות, מאז נוגדנים בדרך כלל צריך להיות וטופחו על RT. לחלופין, אפשר לשלב ניתוח ultrastructural עם נהלים אימונוהיסטוכימיים ידי שימוש בגישה הקפאת-החלפה, שבמהלכה דגימות קבוע קריו הם הפשירו לאט תוך immerged ב כימיקלים קריו-מגן והם הen מוטבע שרפים מיוחדים, כגון Lowicryls. פוסט-הטבעת immunolabeling יכול להתבצע אז על חומר כזה ^12. עם זאת, הקפאה-החלפה וטכניקות קריו-קיבוע הן זמן רב. הם דורשים התקנה של ציוד נוסף ועדיין דורשים דגימות להיחשף ממס אורגני ו מקבעים כימי שיכול לשנות את cytoarchitecture, למרות השימוש בטמפרטורה נמוכה ^{14, 15.} לפיכך, למרות כל ההתקדמות הטכנולוגית הן בבית LM ורמת EM, קיבוע כימי של רקמת המוח, במיוחד עם acrolein, נשאר שיטה בעלות נמוכה זמן יעיל לשלב אימונוהיסטוכימיה עם EM ^16.

בעשורים האחרונים, נעשו ניסיונות רבים למצוא תערובת של אלדהידים המספקים לשימור רקמות הטוב. לפני 1960, מקבע כימי רק כי נתן תוצאות מקובל EM היה tetroxide אוסמיום. עם זאת, tetroxide אוסמיום הוא רעיל ביותר ויקר, מניעת השימוש בו דרך מערכת כלי דם כדי לתקן איברים כמו המוח. Acrolein הוצג בשנת 1950 מאוחר כשיטה אמינה לשימור רקמות בעלי החיים מתאים תצפית EM של מבנים הסלולר ^17. זה חודר לרקמה עמוקה יותר ומגיב מהר יותר מאשר אלדהידים אחרים כאשר נעשה שימוש עבור קיבוע על ידי טבילה ומאפשר שימור טוב של רכיבים ציטופלסמית, עם הצטמקות מינימאלית של הרקמה ^17. תכונה כזו נותנת קיבוע acrolein יתרון ברור על פני אלדהידים אחרים בעת שימוש ברקמה טריה, על ידי מתן אפשרות לוקליזציה מדויקת יותר של חי תרכובות מולקולריות, כגון אנזימים וחלבונים אחרים ^18. ואכן, שיטה זו הוכחה לאורך השנים כשיטה יעילה ונוחה בעלות נמוכה של קיבוע עבור להדמיה ברמה EM במינים רבים, כולל דו חיים מכרסמים, כפי שהוא יעיל stabiliפפטידים וחלבוני zes, שומרים antigenicity ומספקים יחסית ללא פגע ultrastructure כאשר נעשו שימוש בשילוב עם אלדהיד אחר קוֹבֵעַ ^{16, 18, 19, 20, 21.} הפרוטוקולים לקיבוע acrolein במכרסמים יש ומאז כבר טופל ו שימוש נרחב, בעיקר על ידי קבוצת פיקל, ליישם immunolabeling כפול עבור ^{16 EM, 22.} כמה קבוצות שהשתמשו קיבוע acrolein ברקמת המוח הפרימטים הלא-אנושי ^23. עם זאת, למיטב ידיעתנו, יש רק פרוטוקול אחד שפורסם ביעילות המתאר קיבוע כימי עם acrolein ב פרימטים לא אנושיים התואמת EM immunolabeling ^24.

במאמר זה, אנו מספקים שיטה קלה ואמינה כימיים יעיל לתקן אי-לזמזםמוח הפרימטים עם acrolein, המאפשר שימור לטווח ארוך בפוטנציה יחד עם טרום הטבעת EM immunolabeling והעביר בדיקה.