JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Behandeling van ligamentconstructen met uitoefening geconditioneerd serum: een translatie weefsel techniek model

Published: June 11, 2017
doi:
10.3791/55339
, ,
1Department of Neurobiology, Physiology, and Behavior,University of California, Davis, 2Department of Physiology and Membrane Biology,University of California, Davis, 3Faculty of Kinesiology and Physical Education,University of Toronto

Summary

Wij presenteren een model van ligamentweefsel waarin driedimensionale constructen worden behandeld met het menselijk oefenconditionerende serum en geanalyseerd voor collageengehalte, functie en cellulaire biochemie.

Abstract

In vitro experimenten zijn essentieel om biologische mechanismen te begrijpen; Echter is de kloof tussen weefselkweek van de weefsel en de menselijke fysiologie groot, en de vertaling van bevindingen is vaak slecht. Zo is er voldoende gelegenheid voor alternatieve experimentele benaderingen. Hier presenteren wij een aanpak waarin menselijke cellen geïsoleerd zijn van menselijke voorste cruciale ligamentweefselresiduen, uitgebouwd in cultuur en gebruikt om geanimeerde ligamenten te vormen. Oefening verandert het biochemische milieu in het bloed, zodat de functie van veel weefsels, organen en lichamelijke processen wordt verbeterd. In dit experiment werd ligamentconstructie-cultuurmedia aangevuld met experimenteel menselijk serum dat door oefening 'geconditioneerd' is. Aldus is de interventie meer biologisch relevant, omdat een experimenteel weefsel blootgesteld wordt aan het volledige endogene biochemische milieu, waaronder bindende eiwitten en aanvullende verbindingen die kunnen veranderen in tandem met de activiteit van eenOnbekend agent van interesse. Na de behandeling kunnen geanimeerde ligamenten worden geanalyseerd voor mechanische functie, collageengehalte, morfologie en cellulaire biochemie. In het algemeen zijn er vier grote voordelen ten opzichte van traditionele monolayer cultuur en diermodellen, van het fysiologische model van ligamentweefsel dat hier wordt gepresenteerd. Ten eerste zijn ligamentconstructies driedimensionaal, waardoor mechanische eigenschappen ( dwz functie) zoals ultieme trekstress, maximale trekbelasting en modulus, gekwantificeerd kunnen worden. Ten tweede kan de enthesie, de interface tussen boney en sinew elementen, gedetailleerd en binnen functionele context worden onderzocht. Ten derde, het voorbereiden van media met post-oefen serum zorgt ervoor dat de effecten van het door de uitoefening geïnduceerde biochemische milieu, dat verantwoordelijk is voor het brede waaier van gezondheidsvoordelen van de oefening, op een onbevooroordeelde manier wordt onderzocht. Tenslotte bevordert dit experimentele model wetenschappelijk onderzoek op een humane en ethische manier door het gebruik vanDieren, een kernmandaat van de National Institutes of Health, het Centrum voor ziektecontrole en de Food and Drug Administration.

Introduction

Tendon- en ligamentbeserings zijn vaak voorkomend en kunnen afwijkende gevolgen hebben voor normale mobiliteit en levenskwaliteit. Chirurgische interventie is vaak nodig, maar kan een beperkt en gevarieerd succes hebben 4 , 5 . Het huidige begrip van hoe tendons en ligamenten ontwikkelen, rijpen en reageren op letsel zijn onvolledig en daarom zijn effectieve onderzoeksmodellen nodig om inzicht te geven in de ontwikkeling van effectievere behandelingen 5 . Om deze kennisgaping aan te pakken, kunnen diermodellen worden gebruikt, maar in vivo studies zijn inherent complex met moeilijkheden bij het beheersen van het milieu en gericht op interventies op het beoogde weefsel. In tegenstelling hiermee kan de experimentele omgeving gemakkelijk worden gecontroleerd en gecontroleerd met de traditionele monolaagcelcultuur. Deze techniek kan echter de chemische en mechanische omgeving overschrijden en kan dus niet herhalenLaat het in vivo gedrag van de cellen achter. Weefselkunde is in staat om met de controle van de in vitro- omgeving de voordelen van het complexe in vivo- milieu in dierlijke modellen te trouwen en biedt een extra hulpmiddel om de fysiologie te bestuderen. Bovendien, gewapend met een beter begrip van de ontwikkeling van de ligament, kan weefseltechniek ook een bron van transplantaatweefsel bieden wanneer chirurgische reconstructie vereist is 6 . Derhalve valide de hierin beschreven werkwijze een in vitro 3D-gemanipuleerd weefsel dat kan worden gebruikt om de ligamentfunctie en morfologie te bestuderen.

Fibrine-gebaseerde tendon- of ligamentconstructen zijn gebruikt als een in vitro model om fysiologische processen te bestuderen, waaronder collageenfibrillogenese 7 en tendonontwikkeling 8 , evenals translatie toepassingen waarin hun nut als graftweefsel is geëvalueerd in een schaapmodel van anterior cruCiate ligament (ACL) reconstructie 9 . Ons laboratorium heeft eerder een 3D-gecreëerd ligamentmodel opgericht dat zich uitstrekt over twee borstelen, een calciumfosfaat-botvervangend materiaal, cementankers. Dit model kan gemakkelijk worden onderworpen aan verschillende experimentele condities door simpelweg het cultuurmedium aan te vullen met biologische factoren 10 of het toepassen van mechanische stimulatie 11 . Belangrijk is dat dit bot-naar-bot-ligamentmodel de diepgaande analyse van de enthesie mogelijk maakt, de interface tussen boney en senuwelementen, die gevoelig is voor letsel.

In de studie die hierbij werd gemarkeerd om deze methode te presenteren, waren we geïnteresseerd in het effect van oefeninduceerde veranderingen in het biochemisch milieu op ligamentfunctie. Oefening verbetert de cel- en orgaanfunctie in een verscheidenheid aan weefsels door het lichaam 2 , 3 , </suP> 12 , een effect dat kan worden toegeschreven aan de vrijlating van verschillende bekende (bv. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorine-achtige 15 , exosomen 16 , 17 ) en andere onbekende biochemische factoren die in de systemische circulatie worden vrijgegeven . Bovendien wordt het biochemische milieu na de oefening verrijkt met oefeningsgerichte hormonen, waarvan de vrijlating wordt gestimuleerd door sympathische zenuwstelsel stimulatie van secretaire klieren (bijvoorbeeld cortisol en catecholamines uit de bijnier 18 en groeihormoon van de voorste hypofyse 19 ). Nochtans, ik ben n vivo , het is onmogelijk om de effecten van de mechanische stimulus van de oefening te differentiëren van trainingsgeïnduceerde biochemische veranderingen. Hoewel sommige studies de verwachte stijging van bepaalde circulerende hormonen en cytokines hebben gekenmerkt in reactie op exercisE zoals hierboven vermeld, zijn er te veel factoren, zowel bekend als onbekend, om in vitro trouw te herhalen . Dat wil zeggen, het isoleren van een paar factoren voor een in vitro studie is onvoldoende gericht op de complexiteit van de biochemische reactie. In deze studie hebben we onderzocht hoe veranderingen in het serum biochemisch milieu, veroorzaakt door oefening, invloed hebben op de aangebrachte ligamentfunctie. Om de effecten van de biochemische veranderingen te isoleren, kregen we serum van menselijke deelnemers vóór en na een weerstandsbeweging en gebruikten ze 3D-gecreëerde ligamenten die werden gevormd door middel van menselijke anterior cruciale ligament (ACL) fibroblasten te behandelen. Met dit model kunnen we functionele gegevens verkrijgen, met inbegrip van effecten op mechanische eigenschappen en collageengehalte, evenals kwantificeren van effecten op moleculaire signalering.

Protocol

De volgende procedures voldoen aan een protocol dat is goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Universiteit van Californië, Davis; Raadpleeg voorafgaand aan het onderzoek met de lokale ethische raad. 1. Isoleer primaire fibroblasten uit humane ACL-resten OPMERKING: Behou steriliteit en voer alle stappen uit in een biologische veiligheidskast (BSC). Verkrijg goedkeuring van de juiste ethiek review board voor de inzameling en het gebruik van menselijke weefsels zoals hieronder beschreven. Bereid 5x antibiotica / antimycotische (ABAM) oplossing door verdunning van 100x antibiotica / antimycotische oplossing in 1X fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) Verzamel ACL-weefselfragmenten in 5x ABAM-oplossing in een 50 ml conische buis, bewaar bij 4 ° C tot de spijsverteringstap. Knip weefsel in kleinere fragmenten met een scheermesje indien nodig tot een maximale grootte van 1 x 1 x 1 cm 3 . VOORZICHTIG: voldoet aan de lokale biohazard regelgeving voorGoed gebruik van biohazard materiaal en decontaminatie en verwijdering van biohazard afval. Bereid een voldoende volume collageenoplossing voor om de weefselfragmenten te onderdompelen. Dollbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) met 1x penicilline / streptomycine en 20% foetaal bees serum (FBS) en filter bij 0,22 μm ontleden collagease type II (1 mg / ml). Spoel ACL weefsel 3 keer in PBS. Digestweefsel. Zet ACL-weefsel over naar een nieuwe 50 ml conische buis en voeg een voldoende volume collageenoplossing toe om het weefsel te onderdompelen. Incubeer bij 37 ° C overnacht (~ 17 uur). Voordat de spijsverteringstijd voltooid is, bereid u groeimedium (GM) door DMEM-glucosemedia met 10% FBS en 100 U / ml penicilline aan te vullen. 15 minuten voordat de spijsverteringstijd voltooid is, vortex de weefselbevattende 50 ml buis 3 keer per 5 minuten. Gebruik een 25 ml serologische pipet, triturateer het verteerde weefsel krachtig om de ti te brekenSmeer verder en verwijder cellen. Centrifugeer bij 1.500 xg gedurende 5 minuten. Aspirateer de supernatant en resuspendeer pellet in 10 ml GM. Herhaal stappen 1.8-1.9 nog drie keer. Na de laatste centrifugatie, resusteer de pellet in 5-10 ml GM. Gebruik een klein monster van de celsuspensie om een ​​celtelling met een hemocytometer uit te voeren en de levensvatbaarheid van de cel te bepalen met behulp van Trypan Blue. Plateer de celsuspensie op 15 cm weefselkweekplaten bij een dichtheid van 3-4 x 10 5 cellen per plaat. Cultuur tot 70% samenvloeiing in een steriele incubator die bij 37 ° C en 5% CO2 gehouden wordt, waarbij de GM elke 3 dagen wordt gewijzigd. Gebruik of opslaan (zie hieronder) cellen binnen 5 passages. Bevriezen cellen voor toekomstig gebruik. Trypsineer cellen bij 70% samenloop als volgt. Aspireren media en wascellen met PBS. Voeg voldoende voorverwarmde (37 ° C) 0,05% trypsine toe om de bodem van weefselkweekplaten net te bedekken. Plaats platen in de cultuur-incubAtor voor ~ 5 minuten tot cellen zijn losgemaakt (controleer de cellen drijven met behulp van een lichtmicroscoop). Gebruik een pipet om cellen te verzamelen en in een Falcon-buis af te geven. Centrifugeer naar pelletcellen, en resuspendeer cellen in DMEM hoogglucose media met 20% FBS en 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Aliquot cel suspensie in cryovials en afkoelen bij -1 ° C / min gedurende minstens 24 uur. Bewaar bevroren cryovials in vloeibare stikstof. 2. Bereid Silicone Coated Plates Bereid 35 mm weefselkweekplaten: Verwijder deksels en leg de open platen op een vlak oppervlak. Meng siliconen elastomeer kit volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik een 10 ml spuit om ongeveer 2 ml per 35 mm plaat af te geven. Laat de siliconen gedurende 2-3 dagen kamperen bij kamertemperatuur. 3. Brushite cement ankers voorbereiden Vooraf bereiden siliconen omgekeerde vorms die cilindrische we bevattenLls voor ankervorming. Omgekeerde schimmels kunnen worden gemaakt volgens de specificaties van de gewenste vorm en grootte van de anker. Bepaal de gewenste hoogte en diameter van het eindanker. Dit protocol maakt gebruik van een op maat gemaakte kunststof silicone in een 35 mm weefselkweekschotel waarin plastic cilinders met een diameter van ongeveer 3,25 mm zijn geplaatst, waardoor een uiteindelijke schimmelhoogte van ongeveer 6,5 mm mogelijk is. De laatste ankerafmetingen zijn ongeveer 3-3,5 mm in hoogte en ongeveer 3,4 mm in diameter met 1,5 mm pen uit de bodem van het anker. Voeg onverharde siliconen toe aan een 35 mm schotel waarin de schimmel wordt gemaakt. Plaats dan plastic cilinders. OPMERKING: De grootte van de plastic cilinders bepaalt de diameter van de laatste ankers. De plaatsing van de plastic cilinders en de gebruikte siliconenhoeveelheid kunnen worden aangepast om ankers van verschillende hoogten te produceren. De dikte tussen de bodem van de putjes in de mal en de bodem van de mal zelf zal dEtermine hoeveel van de pen uit de bodem van het anker kan uitsteken, zodat het anker later in de siliconencoated schotel veilig vastzit. Verwijder de plastic cilinders nadat u het silicone heeft genezen en verwijder de mal uit de 35 mm schotel. Bereid een 3,5 M orthophosphoric / 100 mM citroenzuuroplossing op. Los 0.961 g citroenzuur op in 11,5 ml orthofosforzuur. Breng het volume van de oplossing tot 50 ml met MilliQ water. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur en bescherm tegen licht. Moulds voorbereiden: Plaats een minutienpen in het midden van elke cilindrische put in de matrijzen. Combineer β-tricalciumfosfaat en orthofosforzuur / citroenzuuroplossing bij een concentratie van 1 g / ml in een plastic weegboot op ijs. Meng het cement krachtig met behulp van een plastic celschraper. Tritureren het cement om verder te mengen en pipetemengsel in de vorm te zetten Centrifugeer de gevulde vorm gedurende 1 minuut bij 2.250 x g. Laat de borstietcementankers toe om gedurende de nacht op kamertemperatuur te zetten. Verwijder de ankers van de vorm en steek twee ankers 12 mm uit elkaar in elke siliconen beklede plaat. Steriliseer geplaatste platen door te sprayen met 70% ethanol, vulling van beide platen en deksels, en in een BSC te plaatsen. Na minstens 30 minuten, schuif platen en vervang deksels, indien nodig, in de BSC opslaan. 4. Verkrijg menselijk serum Zorg ervoor dat de goedkeuring van het betreffende ethiek review board is verkregen voor dit protocol. Zorg ervoor dat schriftelijke geïnformeerde toestemming van menselijke personen is verkregen om deel te nemen aan een bepaalde interventie ( bijv . Oefening, voeding of medicijninterventie) die de gewenste veranderingen in serum zal beïnvloeden. Hier beschrijven we de collectie in rust en 15 minuten na verzetbeweging. Met behulp van een getrainde phlebotomist, ontvang een rustend bloedmonster van een deelnemer door venipuncture in een geschikte geëvacueerde container. </li> Verzamel een bloedproef na de oefening gedurende 15 minuten nadat de deelnemers het gewenste oefenprotocol hebben ingezet. Zoals eerder beschreven 1 , gebruik het weerstandsbewegingsprotocol in dit experiment om een ​​endogene biochemische reactie te stimuleren. Laat deelnemers vijf sets legprikken uitvoeren met een minuut rust tussen sets. Vervolgens voeren de deelnemers een aantal knieverlengingen en een reeks hamstringkrullen achtereenvolgens zonder rust en herhaal dan de back-to-back oefeningen drie keer met 1 min rust tussen sets. Laat het bloed stollen voor centrifugeren bij 1.500 xg gedurende 10 minuten. Onder steriele omstandigheden overbrengen serum naar steriele buizen voor toekomstige media-aanvulling (serum opgeslagen bij 4 ° C) en biochemische analyse (een kleine aliquot serum opgeslagen bij -20 ° C). 5. Form Engineered Ligaments OPMERKING: Voer vooraf de primaire fiBroblasts en bereiding siliconen-beklede platen met pinned borstelen ankers. Reagens voorbereiden: Bereid trombine voor. Oplos trombine oplossen bij 200 U / ml in DMEM hoge glucose media. Filter bij 0,22 μm, aliquot, en opslaan bij -20 ° C. Bereid fibrinogeen. Oplosfibrinogeen oplossen bij 20 mg / ml in DMEM hoge glucose media. Incubeer gedurende 3-4 uur in een 37 ° C waterbad, wervelend om de 30 minuten om de oplossing te helpen oplossen. Filter bij 0.22 μm (meerdere filters kunnen nodig zijn), aliquot, en opslaan bij -20 ° C. Bereid aprotinine. Los aprotinine op in 10 mg / ml in water. Filter bij 0,22 μm, aliquot, en opslaan bij -20 ° C. Bereid aminohexaanzuur. Los aminohexaanzuur op 0,1 g / ml in water op. Filter bij 0,22 μm, aliquot, en bewaar bij 4 ° C. Bereid ascorbinezuur op. Oplossen ascorbinezuur in DMEM hoge glucose media bij een concentratie van 50 mM. Filter bij 0,22 μm en berg bij 4 ° C. <Li> Bereid L-proline op. Los L-proline in PBS op bij een concentratie van 50 mM. Filter bij 0,22 μm en berg bij 4 ° C. Bereid transformatiegroei factor-β1 (TGF-β1) op. Reconstitute TGF-β1 volgens de richtlijnen van de fabrikant bij een concentratie van 10 μg / ml. Aliquot en opslaan bij -20 ° C. Bepaal het aantal constructies dat nodig is voor het experiment en zorg ervoor dat er voldoende getallen van geplaatste platen worden bereid. Zowel biologische als technische replicaten worden aanbevolen. In de hier beschreven studie 1 gebruikt u duplicaat technische replicaten en 12 biologische replicaten (serum uit 12 personen in rust en na oefening). OPMERKING: Voer de volgende stappen uit onder steriele omstandigheden in een BSC. Breid cellen uit door in 15 cm platen te cultiveren tot 70% samenloop. 2.5 x 10 5 cellen zijn per construct vereist. Trypsineer cellen en resuspenderen in GM bij een concentratie van 3,67 x 105 cellen / ml. Genereer een master mix voor het aantal benodigde constructies. Voor 1 construct bevat de master mix 681 μL cel suspensie (bevattende 2,5 x 10 5 cellen), 29 μL trombine, 2 μL aprotinine en 2 μL aminohexaanzuur. Na het mengen van de meestermix goed, voeg 714 μL toe aan elke stokplaat in een 'figuur 8' patroon rond de brushite cementankers. Zorg ervoor dat de mastermix direct contact maakt met de zijkanten van de ankers. Tik voorzichtig op elke plaat om de master mix gelijkmatig over de plaat te verdelen. Voor één plaat tegelijkertijd voeg 286 μL fibrinogeen druppelsgewijs gelijkmatig over één plaat toe en schuif de plaat onmiddellijk heen en weer en zij naar de kant over het oppervlak van het BSC om het fibrinogeen te verdelen om de cel-ingebedde fibrine gels te vormen . Ga door naar de volgende plaat. Plaats de constructen in een steriele incubator die bij 37 ° C en 5% CO2 gehouden wordt en incuberenGedurende tenminste 15 minuten om polymerisatie van het fibrinogeen mogelijk te maken. Bereid voldoende voedingsmedium (FM) voor 2 ml per construct. Supplement GM met 200 μM ascorbinezuur, 50 μM proline en 5 ng / ml TGF-β1. Voeg 2 ml FM toe om elk constructie te bedekken. Cultuur worden de constructies in een steriele incubator onderhouden bij 37 ° C en 5% CO 2 gedurende 14 dagen of naar het gewenste eindpunt, verversen de media elke tweede dag met 2 ml FM 6. Trek Testing Engineered Ligamenten OPMERKING: Het testen van de treksterkte werd uitgevoerd met behulp van een op maat gemaakte trektester in een PBS-bad; Omgekeerde gegoten grips die zijn gekoppeld aan de krachttransducer houden de borstiet cement ankers in de plaats tijdens de test. Bepaal de lengte en breedte van de ligamentconstructies met behulp van digitale calipers; Bereken het doorsnedeoppervlak van het weefsel. Ontkoppel het ligamentconstructie van de plaat en plaats de ankers in deOmgekeerde gegoten grips, waardoor het construct ondergedompeld is in PBS. Pas de afstand tussen de grepen aan, stel de lengte van het construct in op de oorspronkelijke lengte. Begin de test: Span het construct tot een storing van 0,4 mm / s (of ~ 3% / s). Na afloop van de test, verwerk de weefselresiduen voor collageengehalte (zie rubriek 7). Uit de resulterende load-deformation data, bereken stress-stam data en kwantificeer mechanische eigenschappen van interesse; Bijvoorbeeld de maximale trekbelasting, de ultieme treksterkte en de modulus ( dwz elastische eigenschap boven een lineair gebied van de spanningsdrukkromme). 7. Kwantificering van het gehalte aan collageen van geanimeerde ligamenten Verwijder geanimeerde ligamenten van kwastiet cement ankers en droog bij 120 ° C gedurende 25 minuten. Bepaal de droge massa van constructen en plaats in afzonderlijke 1,5 ml buizen. Droge constructies kunnen bij kamertemperatuur worden opgeslagenTot verdere verwerking. Voeg bij elke construct 200 μL 6 M HC1 toe. Kook bij 120 ° C in een verwarmingsblok gedurende 2 uur in een dampkap. VOORZICHTIG: HCl is sterk corrosief en zuur, het gebruik van kogelvrije / veilige slangen of een andere manier om slangen te bevestigen wordt aanbevolen. Centrifugeer de buizen kort om vloeistof te verzamelen en laat ze niet open staan ​​om gedurende 1,5 uur in een dampkap bij 120 ° C in een verwarmingsblok te verdampen. Resuspendeer de resulterende pellet in 200 μL hydroxyproline buffer. Bewaar bij -20 ° C totdat nodig. Bereid hydroxyproline buffer. Voeg in 300 ml water 16,6 g citroenzuur, 4 ml azijnzuur, 11,4 g NaOH en roer tot opgelost. PH tot 6-6,5 en breng volume tot 500 ml. Voeg 250 μL tolueen toe als een conserveermiddel en bewaar bij 4 ° C beschermd tegen licht. Reagentia opmaken. Bereid trans-4-hydroxy-L-proline op. Oplossen in water om een ​​oplossing van 4 mg / ml te maken. <Li> Bereid chloramine-T. Oplossen in water om een ​​oplossing van 14,1 mg / ml te maken. Bereid aldehydeperchloraat op. 1,5 g 4-dimethylaminobenzaldehyde oplossen in 6 ml 1-propanol, 2,6 ml perchloorzuur (VOORZICHTIG: corrosieve sterke oxidator, gebruik passende voorzorgsmaatregelen) en 0,5 ml water. In een stel nieuwe 1,5 ml buizen verdund een monster van elke geresuspendeerde pellet in hydroxyproline buffer tot een volume van 200 μl. OPMERKING: verdunningen kunnen variëren van 1: 4 tot 1:50 van het monster: buffer afhankelijk van het verwachte collageengehalte van het monster; Zo kan een test-en-fout testen nodig zijn om een ​​verdunningsfactor te bepalen die geschikt is voor de gegeven steekproefset (dwz de monsters naar het midden van de standaardkromme plaatsen). Bereid de hydroxyproline normen op. Verdun hydroxyproline in hydroxyproline buffer (zie rubriek 7.5.1) tot 80 μg / ml. Voer seriële verdunningen uit om 6-8 200 μL normen tussen 0-20 μg / ml te maken. Voeg 150 μl 14,1 mg /Ml Chloramine T oplossing voor elke standaard en verdund monster. Vortex en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Voeg 150 μL aldehydeperchloraatoplossing toe aan elk monster en verdund monster. Vortex en incuberen in een verwarmingsblok bij 60 ° C gedurende 15 minuten. Verwijder de overmaat aldehyde-perchloraatoplossing als gevaarlijk afval volgens de plaatselijke voorschriften (bevat perchloorzuur). Laat normen en monsters afkoelen, alvorens 200 μL van elk, in tweevoud, in platen met 96 putjes te vergelijken. Lees plaat bij 550 nm in een spectrofotometer. Verwijder de plaat en het resterende volume in 1,5 ml buizen als gevaarlijk afval volgens de plaatselijke voorschriften (bevat perchloorzuur). Berekening van de totale collageen- en collageenfractie. Zet de absorptiewaarde voor elk monster op microgram hydroxyproline met behulp van de hydroxyproline standaard curve. Vermenigvuldig elke put met 2,5 om de hoeveelheid hydroxyproline in te berekenenHet verdunde monster. Onthoud dat slechts 200 van het totale mengsel van 500 μL (200 μl verdund monster + 150 μL chloramine T +150 μL AP oplossing) aan elke monsterput toegevoegd wordt. Vermenigvuldig met verdunningsfactor (Sectie 7.7) om de hoeveelheid hydroxyproline in het oorspronkelijke monster te berekenen. Verdeel door 0.137 om de hoeveelheid collageen te berekenen (veronderstelt dat collageen 13,7% hydroxyproline 20 bevat ). OPMERKING: Het overvloed van moedermelkhydroxyproline in collageen varieert licht over weefsels en zoogdieren; Bijvoorbeeld, de achillespees van varkens en schapen bevatten 13,5 en 13,7% (hydroxyproline massa / droge weefselmassa) respectievelijk 21 . Gebruik hier 13,7% om het percentage hydroxyproline in collageen te schatten, die gebruikt wordt om het collageengehalte van een weefselmonster te berekenen aan de hand van de volgende vergelijking: Verdeel door de droge massa om de collageen uit te berekenenCtion en omzetten naar een percentage. 8. Kwantificering van moleculaire eindpunten OPMERKING: Naast de primaire uitkomsten van trekproeven en collageengehalte kunnen moleculaire eindpunten worden gemeten op 2D of 3D weefsel om mechanisch inzicht toe te voegen. Bioassays kunnen gebruikt worden om moleculaire eindpunten te bepalen (zie onderstaande paragraaf voor context. De impact van het post-oefen serum milieu op in vitro ligamentfunctie). Voor 3D weefsel: Bereid constructen volgens stap 5 hierboven. Na constructbehandeling / interventie, snap-freeze constructs in vloeibare stikstof. Met behulp van een mortel en stamper afgekoeld op droogijs, bouwt de molen in een poeder. Ga verder met stap 8.4 / 5). Voor 2D weefsel: Cultuur menselijke ACL fibroblasten om samen te lopen in een monOlayer in plaatjes met 6 putjes die DMEM bevatten. Aspirate DMEM en gebruik behandelingsmedia volgens uw experimentele strategie ( bv . Tijdcursus of dosis respons experimenten). Aspiratie behandelingsmedia en wascellen met PBS. Schraapcellen verzamelen met een geschikte extractiebuffer / reagens (zie volgende). Proteïne expressie analyse: Gebruik een cytosolische extractie buffer ( bijv . 250 mM sucrose, 50 mM Tris pH 7,4, 5 mM MgCl2, en protease / fosfatase inhibitor cocktail) om eiwitlysaten te verkrijgen. Voer eiwitconcentratie-assay uit en ga verder analyseren volgens standaard western blot procedures. Gene expression analyse: Isoleer totaal RNA met 500 μL RNA isolatie reagens volgens de instructies van de fabrikant om hoogwaardige RNA te verkrijgen. Voer reverse-transcriptie en real-time kwantitatieve PCR analyse volgens standaard procedures. DNA-isolatie: Isoleren en kwantificeer gEnomic DNA met behulp van DNA isolatie reagens volgens de instructies van de fabrikant. Kwantificeer de DNA-concentratie door gebruik te maken van een spectrofotometer om de monsterabsorptie bij 260 nm te meten.

Representative Results

Overzicht van gecombineerde ligamentvorming en experimentele interventie Figuur 1 toont een overzicht van de vorming van aangebrachte ligamenten. Brushietcement, een botvervangend materiaal 22 wordt bereid door een orthofosforzuur / citroenzuuroplossing met β-tricalciumfosfaat in cilindrische putjes te combineren. Als alternatief, als de mechanische functie van de weefsels niet rechtstreeks wordt gemeten, kunnen 3-0 zijde hechten worden gebruikt als ankers bij de vorming van een weefsel. Deze worden 12 mm uit elkaar gesneden in siliconen bedekte 35 mm schotels en gesteriliseerd door nat te worden in 70% ethanol. Fibroblasten worden geïsoleerd uit voorste cruciale ligamentresiduen verkregen tijdens ACL reconstructiechirurgie. Na expansie worden 2,5 x 10 5 cellen ingekapseld in een fibrinegel die is gevormd in de brushite-cement-ankerpen. Na vorming, ligament constrUcts kunnen worden onderzocht op veranderingen in mechanische eigenschappen, collageengehalte, cel proliferatie, genuitdrukking, eiwitgehalten en weefselmorfologie. Gedurende de cultuur contracten de cellen de fibrinegel en vormen een lineair weefsel tussen de twee ankers ( Figuur 2A ). Na 1-2 dagen in de cultuur hebben de cellen gehecht aan de fibrinegel, de verlengde celprocessen en tractiekrachten uitgeoefend ( Figuur 2B ). Aangezien de fibrinegel wordt gecontracteerd door tractiekrachten en afgebroken door cellulaire enzymen, wordt spanning gegenereerd tussen de twee ankerpunten en onze cellen richten zich evenwijdig aan deze as ( Figuur 2B ) en beginnen collageen te deponeren. Na 4-5 dagen hebben de constructen rond de ankers een contract gevormd die een lineair cilindrisch weefsel vormt ( Figuur 2A ; op dit punt kunnen externe stimuli op het systeem worden toegepastEntie op dit moment vermijdt het lineaire weefselvormingsproces te verstoren). Interventies kunnen bestaan ​​uit het aanvullen van de cultuurmedia met menselijk of dierlijk serum na een bepaalde interventie, exogene cytokinen en groeifactoren, waarbij mechanische stimulatie wordt toegepast of andere milieufactoren zoals zuurstofspanning verandert. Met behulp van groeimedia (DMEM met 10% FBS en 100 U / ml penicilline) aangevuld met 200 μM ascorbinezuur, 50 μM L-proline en 5 ng / ml TGF-β1, hebben we vastgesteld dat cel proliferatie gedurende een 2 week lange cultuur Periode ( Figuur 2C ) en inderdaad lichtmicroscopie onthult een dicht weefsel met hooggelijnd cellen op 14 dagen kweek ( Figuur 2B ). Beoordeling van aangebrachte ligamenten Aan het einde van de cultuurperiode kunnen geanimeerde ligamenten in een variëteit worden beoordeeldY van manieren. Een belangrijk voordeel van dit systeem is het vermogen om functionele veranderingen in het weefsel te bepalen via mechanisch testen, een vitale beoordeling die de mechanische rol van natieve ligament geeft. Uniaxial tensile testing kan worden gebruikt om mechanische eigenschappen te meten, inclusief belasting tot falen, ultieme treksterkte en Young's modulus. Viscoelastische eigenschappen kunnen ook worden gemeten met stress ontspanning en kruip testen. Figuur 3A toont een geanimeerde ligament die in omgekeerde gegoten grepen wordt gehouden in een op maat gemaakte uniaxiale trektester. De juiste greep is vastgemaakt aan een krachttransductor om de belasting over de ligament te meten, aangezien het weefsel aan mislukking wordt gespannen. Figuur 3B toont een representatief spanningsstamplot voor een test naar falen. Na het mechanisch testen kunnen dezelfde constructies worden gedroogd en verwerkt voor een hydroxyproline assay 23 om het totale collageengehalte te beoordelen, evenals andere biocheMische analyses. Met een voldoende aantal extra monsters per conditie kan een grondig onderzoek van een experimentele interventie uitgevoerd worden, met inbegrip van de effecten daarvan op celproliferatie, gen- en eiwituitdrukking en histologische morfologie. Hoewel 14 dagen een typisch eindpunt voor onze studies zijn, blijven de aangebrachte ligamenten in hun mechanische eigenschappen en collageengehalte door 28 dagen van de cultuur, zoals getoond in Figuur 3C , verbeteren en kunnen gedurende ten minste 3 maanden in cultuur 24 overleven. Donorvariabiliteit is een belangrijke overweging voor experimentele herhaalbaarheid. Figuur 4 toont een representatief experiment gemeld door Lee et al. 25 vergelijken van 7 verschillende ACL donoren (n = 3 mannelijke en n = 4 vrouwelijke) die typische treksterkte en collageengehalte tonen na een cultuur van 2 weken in de eerder beschreven Aangevulde groeimedia. Met behulp van cellen uit vergelijkbare ACL-collecties, leeftijd van donor, tijd na verwonding, geslacht, enz. Tonen de aangebrachte ligamenten een lage variabiliteit tussen donoren en soortgelijke eigenschappen tussen mannelijke en vrouwelijke donoren, met uitzondering van het verschil in collageenfractie. In de bovengenoemde studie werden ingebouwde ligamenten gebruikt als een in vitro model om te onderzoeken waarom vrouwen een significant groter risico op ACL-verwonding hebben dan mannen, en aangetoond dat ACL-fibroblasten die geïsoleerde zijn van vrouwelijke donoren, inherent niet zwakker en minder collageen-gecreëerde ligamenten vormen 25 . De invloed van het serum-milieu na de oefening op in vitro ligamentfunctie We hebben eerder het vermogen van geanimeerde ligamenten aangetoond om gebruikt te worden om fysiologische processen 1 ,Ss = "xref"> 25. In het volgende representatieve experiment zoals gemeld door West et al. 1 , hebben we de biochemische effecten van oefening op ligamentfunctie bepaald en de methodologie en bevindingen hier benadrukt. We hebben geanimeerde ligamenten gevormd door gebruik te maken van menselijke ACL-cellen en een interventie toegepast, op dag 7 van de cultuur, bestaande uit cultuurmedia geconditioneerd met menselijk serum verzameld voor- of na-oefening. Kortom, we werkten gezonde jonge mannelijke deelnemers aan en verzamelden bloedmonsters vóór en na een acute inspanningstraining die circulerende hormonen en cytokinen verhoogde, waaronder menselijk groeihormoon (GH). Menselijk serum werd geïsoleerd uit pre- en post-oefenbloedmonsters en gebruikt in plaats van foetaal runder serum in het kweekmedium voor de tweede week van geanimeerde ligamentkweek ( Figuur 5A ). Pre- en post-oefen serummonsters werden geanalyseerd met behulp van ELISA voor veranderingen in GH en insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1), deWaarvan de concentratie door oefening kan veranderen ( figuur 5B ). Deze informatie werd gebruikt om de serumeffecten op de aangebrachte ligamenten te correleren met veranderingen in het serum als reactie op de oefening. Na een cultuurperiode van 14 dagen werden de ligamentconstructies geëvalueerd onder toepassing van mechanisch testen en een hydroxyprolinebepaling van collageengehalte en bleek een significante toename van zowel de maximale trekbelasting als het collageengehalte in reactie op het na-uitoefenings serum. Met het doel om te beoordelen of dit effect betrekking had op uitoefeningsgeïnduceerde afgifte van GH of IGF-1, werden aangebrachte ligamenten gevormd in een apart experiment en behandeld met een dosisrespons van ofwel menselijke recombinante GH of IGF-1. Interessant genoeg, terwijl serum GH in het bloed verhoogde ( Figuur 5B -i), verhoogde de progressieve toename van recombinante GH-concentratie in het kweekmedium het collageengehalte niet ( Figuur 5Di) of mechanischEigenschappen (gegevens niet getoond) in geanimeerde ligamenten. Daarentegen verhoogden de serum IGF-1 niveaus na de oefening niet, maar een dosis-respons-experiment bleek dat toenemende niveaus in de kweekmedia het collageengehalte van ligamentconstructen verbeterden ( Figuur 4D- iii). Dus, terwijl oefening resulteerde in robuuste toenames in na-uitoefening GH, verhoogt het dosis-respons experiment met behulp van rhGH twijfel of GH direct verantwoordelijk is voor de fenotypische verbetering van de aangebrachte ligamenten (tenminste is de 22 kDa isoform alleen niet Lijken verantwoordelijk te zijn). Omgekeerd, terwijl het serum IGF-1 niet bij 15 minuten na de oefening werd veranderd, bleek dat rhIGF-1 over een breed scala van concentraties bleek dat IGF-1 in staat is om collageengehalte te verbeteren; Er dient echter op te worden gewezen dat het verhogen van rhIGF-1 concentraties door middel van een bereik dat de geschatte fysiologische niveaus niet significant verhoogde collageengehalte. Zo is het unieke post-exercise serum enviroNment was belangrijk voor het verbeteren van de mechanica en collageen van geanimeerde ligamenten. In de studie die hierbij is gemarkeerd 1 , was het volume experimentele serum beperkt door ethische overwegingen; Zo werden kortlopende 2D bioassays, die lagere serumvereisten hadden, gebruikt om de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk waren voor de toename van collageen die waargenomen werden, verder te onderzoeken. ACL fibroblasten werden gecultiveerd tot confluentie in platen met 6 putjes en 1 uur behandeld met rest- of post-oefen serum en vergeleken met dosisreacties van recombinante GH, IGF-1, TGF-β1 en de activering van doelwitten in de PI3K / mTORC1 , ERK1 / 2 en Smad signaalwegen werden bepaald. In aanwezigheid van post-oefen serum vertoonde de PI3K / mTORC1 en ERK1 / 2-route grotere activering zoals beoordeeld door fosforylering van respectievelijk S6K ( Figuur 5D- i) en ERK1 / 2 ( Figuur 5D- i).In vergelijking met de reacties van het hormoon- en cytokine-dosis, terwijl GH een klein positief effect had op mTOR-signalering ( Figuur 5D- i) en IGF-1 toonde een positief effect op de laagste dosis, werden de drie behandelingen van GH, IGF-1 en TGF -P1 heeft geen rekening gehouden met de toename van PI3K / mTORC1 en ERK1 / 2 signalering. Gecombineerd, wijzen ons 3D-gemodificeerde ligamentmodel en 2D bioassay data aan dat het na-uitoefenbare serumomgeving de geanimeerde ligamentfunctie en collageengehalte kan verbeteren door middel van activatie van de PI3K / mTORC1 en ERK1 / 2 pathways. Samenvattend, door gebruik te maken van een gecombineerd ligamentmodel gecombineerd met oefengekondisioneerd serum, konden we het effect van het na-oefen-serumomgeving op geanimeerde ligamentfunctie en collageen onderzoeken, ii) veranderingen in het ligamentfenotype corrigeren met veranderingen van het serumhormoonconcentratie, Met als doel om te bepalen welke veranderingen in het serum leidden tot changEs in geanimeerde ligamenten en iii) de reikwijdte van het werk verder door 2D bioassays te gebruiken om moleculaire doelen van het serum biochemische milieu te detecteren om moleculaire mechanismen te bepalen die worden geactiveerd door post-oefen serum, die leiden tot verbeteringen in de ligamentfunctie. Figuur 1: Overzicht van de vorming en het gebruik van geanimeerde ligamenten. Brushite cement ankers worden vervaardigd en vastgelegd in siliconen beklede platen. Primaire fibroblasten worden geïsoleerd en uitgebreid uit ACL resten. Geanimeerde ligamenten worden gevormd door fibroblasten in een fibrine-gel rondom twee borstiet cementankers te inkapselen. Geanimeerde ligamenten worden gekweekt en behandeld met welke specifieke chemische of mechanische (bijvoorbeeld via een bioreactor) stimuli die gewenst zijn. Op het gewenste eindpunt kunnen geanimeerde ligamenten worden verzameld en beoordeeld op mechanicaL eigenschappen, genexpressie, collageengehalte, eiwituitdrukking en histologie. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2. Primaire ligament fibroblasten vormen een fibrine-gebaseerde bot-naar-bot gemanipuleerde ligament die zich uitstrekt over twee borstiet cement ankers. ( A ) Over de tijd contracten de fibroblasten de fibrinegel rond de borstietcementankers die een lineair weefsel vormen. ( B ) In de eerste drie dagen hechten de cellen aan de fibrinegel en oefenen tractiekrachten uit, waarbij de cellen met de lange as van het construct worden afgestemd. Over 14 dagen vormen de cellen een sterk uitgelijnd weefsel. Schaalbalk = 160 μm. ( C ) Het DNA-gehalte van de aangebrachte ligamenten blijft o toenemenVer 14 dagen in cultuur als de cellen prolifereren. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD met n = 3-4 constructen per groep. groepen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Geanimeerde ligament mechanische eigenschappen en collageen inhoud verbeteren over de tijd. ( A ) Ligamentconstructen worden uniaxiaal getest getest om het effect van een bepaalde interventie op de ligamentfunctie te bepalen. Zoals afgebeeld, hebben twee omgekeerde gegoten, 3D gedrukte grips reciprocally gevormde ankers die door de ingenieursteen worden overbrugd. Ankers worden gekoppeld aan een stepper motor en dwingen transducer om spannings / spanningen van het geteste weefsel te genereren, waardoor mechanische eigenschappen kunnen worden bepaald. ( B </ Strong>) Representatieve stress-strain curve van een geconstrueerde ligament gespannen tot falen. In de loop van 28 dagen blijven de ( C ) ultieme treksterkte (UTS), ( D ) maximale trekbelasting (MTL), ( E ) Young's modulus en ( F ) collageenfractie verbeteren. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD met n = 5 constructen per groep. * Geeft significant verschil aan van alle andere groepen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Geanimeerde ligamenten kunnen worden beoordeeld op functionaliteit en biochemische inhoud, waarbij de donorvariabiliteit laag is. Geanimeerde ligamenten werden 7 verschillende donoren gevormd (n = 3 mannelijk, n = 4 vrouwelijk). Na 2 weken oF-cultuur, werden ze beoordeeld op verschillen in ( A ) maximale trekbelasting, ( B ) ultieme treksterkte (UTS), ( C ) Young's modulus, ( D ) dwarsdoorsnedegebied (CSA), ( E ) totaal collageengehalte per Construct, en ( F ) collageen als een fractie van droge massa. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD en statistische significantie was bij Student's t-test. * Wijst significant verschil uit van andere groepen (p <0,05). Figuur aangepast uit Lee et al. 25 Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5. Geanimeerde ligamenten tonen mechanische en biochemische veranderingen in reactie op bioloogGische interventies. ( A ) Serum werd geïsoleerd uit bloedstrekkingen verzameld uit proefpersonen voor- (RestTx) en na-oefening (ExTx) en werden gebruikt om geanimeerde ligamenten te behandelen tijdens de tweede week van de cultuur. ( B ) (i) Menselijk groeihormoon (GH) en (ii) insuline-achtige groeifactor (IGF) -1 niveaus in het rest- en oefenserum werden gekwantificeerd door ELISA. ( C ) Geanimeerde ligamenten behandeld met ExTx aangetoond verbeterde (i) collageengehalte en (ii) maximale trekbelasting. Statistische significantie van gepaarde vergelijkingen (RestTx en ExTx) werd geanalyseerd door een t-test met significantieniveau ingesteld op p <0,05. ( D ) Een dosis-respons van (i) GH en (ii) IGF-1 werd gebruikt om mogelijke bijdragen van deze factoren te bepalen aan de veranderingen in collageengehalte door ExTx. E) 2D bioassays werden gebruikt om de effecten van toenemende doses GH, RestTx en ExTx op moleculaire signaleringsdoelstellingen zoals de fosforylering van (i) S6K Thr38 te vergelijken9 en (ii) ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204 . Statistische vergelijking van meer dan twee experimentele groepen werd uitgevoerd met behulp van ANOVA en Tukey's HSD. Gegevens worden gepresenteerd zoals weergegeven als gemiddelde ± SD. * Duidt op een significant verschil van controle (p <0,05) en § geeft significant verschil aan van 150 ng / ml en 300 ng / ml IGF-1. Figuur aangepast uit West et al. 1 Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het huidige manuscript beschrijft een model van ligamentweefsel dat een nuttig experimenteel platform is voor onderzoekers met een breed spectrum aan onderzoeksonderwerpen, van weefselontwikkeling tot translationele / klinische vragen. Het hier beschreven hier beschreven constructie van ligamenten is gebaseerd op een veelzijdig protocol dat op verschillende punten in de werkstroom kan worden aangepast ( figuur 1 en discussieafdeling ). Verder kan de inherent reductieve aard van de in vitro omgeving dichterbij gebracht worden in het fysiologische gebied door voedermedia aan te vullen met geconditioneerd menselijk of dierlijk serum.

Constructen kunnen worden gevormd met behulp van fibroblasten uit een verscheidenheid aan bronnen
Terwijl de hier beschreven methodologie en representatieve resultaten gebaseerd zijn op het gebruik van primaire ACL fibroblasten, kan het celisolatieprotocol worden aangepast voor het verzamelen van andere soorten primaire fibroblasten. Zoals beschrevenIn figuur 4 blijkt dat aangebrachte ligamenten gevormd met primaire cellen die zijn geïsoleerd van jonge menselijke donoren, een lage donorvariabiliteit hebben. Primaire cellen zijn beperkt door initiële isolatie en doorgangsbeperking; Het gebruik van cellijnen kan de reproduceerbaarheid van experimenten verbeteren. Het gebruik van andere celtypes kan modificaties vereisen in celkweekmedia en fibrinegelformulering. Bijvoorbeeld hebben we geconstateerd dat menselijke mesenchymale stamcellen (MSC's) in de loop van 2 weken geen lineaire weefsels kunnen vormen tussen de borstietcementankers, terwijl hogere digitale flexor-tendonfibroblasten, paardenmierstromacellen, kippenembryonale tendonfibroblasten , En muizen C3H10T1 / 2 MSC's contracten snel en verdelen de fibrinegel om een ​​lineair weefsel te vormen (ongepubliceerde waarnemingen). Dit contrast kan een gevolg zijn van verschillen in celfractiliteit, proliferatie en fibrinolytische enzymproductie.

Toepassing van chemische stoffenEn mechanische stimulatie
In de hierin beschreven werkwijze vormt fibrine-gebaseerde weefsel rond kwastiet cement ankers, waardoor de toepassing van mechanische stimulatie via een rek bioreactor 11 , alsmede voor eindpunt trekstesten mogelijk is. De aanwezigheid van een brushite cement-soft tissue interface (enthesis) biedt ook een kans voor verder onderzoek en verbetering 22 , 26 (zie onderstaande sectie Klinische toepassingen). In deze in vitro omgeving kan de bijdrage van chemische en mechanische factoren gemakkelijker worden geïdentificeerd; Een voorbeeld hiervan is getoond in figuur 5 , waarbij het effect van de na-uitoefenende serumomgeving gescheiden was van de mechanische stimuli van de oefening. Pilot studies kunnen nodig zijn om het tijdschema van experimentele interventies, samenstelling van behandelingen en passende eindpunten te bepalen om een ​​waarneembare verandering te verwachten. foBijvoorbeeld in de studie na het uitoefenen van serum 1 werd de lengte van de experimentele behandeling beperkt door de toevoer van serum dat gebruikt werd om media aan te vullen, van welke constructies elke tweede dag werden gevoed. Verder werd tijdens de tweede week van de cultuur kweekmedia aangevuld met rest- of post-oefen serum met ascorbinezuur en L-proline onderhouden terwijl TGF-β1 werd verwijderd. TGF-β1 is een bekende profibrotische groeifactor die in serum na oefening 27 toeneemt. Om te voorkomen dat obscure TGF-β1-gerelateerde effecten van het post-oefen-serum voorkomen, werd dit cytokine niet gehandhaafd in het kweekmedium.

Dit getypeerde ligamentmodel kan ook gebruikt worden om het effect van mechanisch rek te testen. Door techniek omgekeerde gemodificeerde grips om de borstiet cement anker uiteinden vast te houden (vergelijkbaar met de uniaxiale trekstoftester afgebeeld in Figuur 1 ), kunnen stretch bioreactoren worden ontworpen om te beschikken over eng Geïsoleerde ligamenten. Ons laboratorium heeft eerder dit model gebruikt om de moleculaire signaleringsrespons van geanimeerde ligamenten te onderzoeken naar uniaxiale trekstrek in een op maat gemaakte bioreactor 11, die een beter inzicht zal geven in het rationeel ontwerp van een in vitro stretchparadigma of zelfs mogelijk in vivo Rek / activiteit / therapeutische toepassingen.

Beoordeling van aangebrachte ligamenten
Net als bij traditionele monolaagcultuur kunnen 3D-constructen worden geanalyseerd voor gen / eiwit expressie; Bovendien biedt hun 3D-morfologie ook de mogelijkheid om functionele en morfologische veranderingen te beoordelen en constructies kunnen in de cultuur worden gehandhaafd voor langetermijnstudies ( Figuur 3 ). Hoewel aangebrachte ligamenten niet gelijkwaardig zijn aan inheemse, rijpe ligamenten, hebben ze gelijkenis met het ontwikkelen van pezen / ligamenten en gedragen zich op soortgelijke wijze als inheemse weefsel in reactie op voedingsstoffen"> 26, groeifactoren 10 , hormonen 25 en oefening 11 , 28. Aldus, terwijl voorzichtigheid is gegarandeerd alvorens algemene generalisaties uit elk in vitro model te maken, kunnen resultaten van ligamentconstructietests een bepaald fysiologisch mechanisme onthullen of anderszins zijn Onmogelijk om in vivo te onderzoeken .

Supplement voedingsmedia met geconditioneerd serum voor een flexibel en dynamisch model met brede toepassingen
Het menselijke serum metabolome is een milieu van ~ 4.500 verbindingen, waaronder, maar niet beperkt tot, glycoproteïnen, lipoproteïnen, lipidederivaten, energiesubstraten, metabolieten, vitamines, enzymen, hormonen, neurotransmitters en een overvloed aan bouwstenen / tussenproducten. 29 Verdere inspectie van het humane serummetabolome volgens de samengestelde klassen 29 onthult additieOnale voordelen van het integreren van experimentele serum in in vitro experimenten. Dat wil zeggen dat de meerderheid van de 4500 verbindingen in serum hydrofoob of lipide afgeleid is, waarbij het belang van bindende eiwitten voor transport / oplosbaarheid wordt onderstreept. Hieruit blijkt dat het transportdynamiek van de endogene verbinding experimenterend is, en dus biobeschikbaarheid en interactieverbindingen, bijna onmogelijk zou zijn. Zo is experimenteel serum bijzonder effectief voor het bestuderen van verbindingen die bekend zijn dat ze afhangen van accessoire moleculen voor solubilisatie, transport, doelbinding en werkingsmechanisme.

Ons laboratorium heeft een langdurige interesse in de gezondheidsvoordelen van de oefening. Oefening verbetert de cel- en orgaanfunctie in een verscheidenheid van weefsels door het lichaam 12 , een effect dat kan worden toegeschreven aan een aantal factoren (bijvoorbeeld IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorine-achtige 15 ,Exosomen 16 , 17 ) die in systemische circulatie worden vrijgegeven. Het biochemische milieu na de uitoefening weerspiegelt factoren die vrijkomen uit zowel contractieve skeletspieroefeningsresponsieve hormonen als factoren die worden vrijgegeven als gevolg van sympathische zenuwstelsel stimulatie van secretaire klieren (bijvoorbeeld cortisol en catecholamines uit de bijnier 18 en groei Hormoon van de voorste hypofyse 19 ). We hebben onlangs een model van pre- en post-oefen serum gebruikt om de effecten van het uitoefen-geïnduceerde biochemische milieu op geanimeerd weefsel te onderzoeken. 1 Terwijl tal van belangrijke oefeningsgerelateerde onderzoeksvragen blijven, is het model op geen enkele manier beperkt op deze manier. Bijvoorbeeld kan serum worden verkregen, hetzij uit dierlijke of menselijke bronnen, na deet- of farmacologische interventies, of uit verschillende leeftijdsgroepen of klinische populatieS 30 . Op deze manier zullen exogene of endogene verbindingen van belang aanwezig zijn in het serum en behandelingsmedia, in biologische beschikbare hoeveelheden en in interactie met het doelweefsel samenwerken met het endogene milieu ( dwz in een meer fysiologische context). Deze aanpak is dynamisch omdat het hoogstwaarschijnlijk is dat een bepaalde interventie een multi-orgaan (en multi-compound) effect zal uitoefenen en daarmee het fysiologische milieu geco-modificeerd zal worden. Hoewel deze aanpak bepaalde uitdagingen voordoet, aangezien meerdere systemische biochemische variabelen tegelijkertijd veranderd zijn, is het een aanpak die kan helpen bij het oplossen van nadelen van zuiver reductieve experimentele methodologie 31 , 32 . Gecombineerd, het implementeren van geconditioneerd serum samen met een weefselgemanipuleerd ( in vitro biomimetisch ) weefsel kan gebruikt worden als hulpmiddel voor fysiologie, voeding en klinische onderzoeksvragen.

<stronG> Klinische toepassingen zijn talrijk
Het hier aanwezige weefseltechniekmodel kan worden gebruikt om anatomische en klinische onderzoeksvragen te onderzoeken die traditionele in vitro modellen niet kunnen. Een ligament of pees in vivo bevat een soft-to-hard weefseltransitiegebied genaamd de enthesis. De enthesis, die kwetsbaar is voor mechanisch stressgerelateerde verwonding 33 , kan in dwarsdoorsnede worden bestudeerd via histochemische en elektronenmicroscopietechnieken 22 , 26 . Deze unieke interface is dubbel belangrijk voor mensen met een lage of beperkte mobiliteit, aangezien lichamelijke inactiviteit het vermogen van bindweefsel vermindert om belastingen over te brengen naar gebieden met een lage tot hoge overeenstemming 34 , wat uiteindelijk resulteert in een algehele afname van weefsel naleving en verhoogd letselrisico.

Ons lab heeft onlangs dit tissue engineering model 25 gebruikt/ Sup> een andere populatie, vrouwelijke atleten, die risico lopen op letsels van het bindweefsel, te modelleren: de incidentie van ACL-letsel is ongeveer vijf keer groter dan hun mannelijke tegenhangers 35 . Potentiële mechanismen die dit geslachtsgebonden verschil vormen bij letsel, werden onderzocht door ligamentconstructies te behandelen met fysiologische concentraties van het vrouwelijke geslachtshormoon, oestrogeen, bij concentraties die de stadia van de menstruatiecyclus nabootsden. Interessant genoeg verhinderden hoge concentraties oestrogeen de genuitdrukking en de activiteit van lysl oxidase, het primaire enzym dat verantwoordelijk is voor het creëren van lysine-lysine crosslinks in de collageenmatrix van ligamenten en pezen. Belangrijk is dat 48 uur hoge oestrogeen (om de folliculaire fase te simuleren) de structurele stijfheid van de ligament verminderen zonder de collageendichtheid van de constructen te veranderen. Uit een fysiologisch perspectief suggereert dit dat de stijging van de ligamentlaxiteit bij vrouwtjes althans ten dele kan afnemenCrosslink-vorming. Uit een experimenteel perspectief benadrukken deze bevindingen 25 het nut van het 3D-constructmodel, waardoor de functionele verknopingsactiviteit onderzocht kon worden. Uit een klinisch perspectief kan dit model nu gebruikt worden om snel te screenen op interventies die de negatieve effecten van oestrogeen van ligamentfunctie kunnen voorkomen.

Eindopmerkingen
Hier hebben we een gedetailleerde methodologie voor de vorming van geanimeerde ligamenten en hun nut als een 3D in vitro weefselmodel gepresenteerd. Het model is zeer aanpasbaar voor een breed scala van doelstellingen, waardoor flexibiliteit in het celtype, interventies en uitkomstmaatregelen van belang is. Supplementen van voedingsmedia met geconditioneerd serum voegt een fysiologische context toe die niet kan worden bereikt in een traditionele in vitro omgeving, waardoor de modellering van in vivo fysiologie wordt verbeterd. Kortom, we geloven dat dit een brede toepasselijke modus isL met spannende implicaties voor de bevordering van zowel de velden van fysiologie als weefselkunde.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een NSERC postdoctorale gemeenschap (DWDW), een ARCS Foundation Scholarship (AL) en een UC Davis College of Biological Sciences grant (KB).

Materials

Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20 Entomoravia N/A For brushite cement anchors; include info on multiple sources and alternative products
β-tricalcium phosphate Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK) N/A For brushite cement anchors; include whether it's hazardous /toxic
o-phosphoric acid, 85% (w/w) EMD Millipore PX0995 For brushite cement anchors; include info on preparation
Citric acid Sigma-Aldrich 251275-500g For brushite cement anchors
Falcon 35mm tissue culture dishes Fisher Scientific 08-772A For silicone-coated plates
Sylgard 184 silicone elastomer kit Ellsworth Adhesives  4019862 For silicone-coated plates
1X Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific SH3002802 For cell isolation and expansion
100X antibiotic/antimycotic solution VWR 45000-616 For cell isolation
Type II collagenase Thermo Fisher Scientific 17101015 For cell isolation
100X penicillin/streptomycin solution Thermo Fisher Scientific 15140122 For cell isolation
Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated EMD Millipore SCGP00525 For reagent sterilization
DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine VWR 10-013-CV For cell and tissue culture
Fetal bovine serum BioSera FBS2000 Component of tissue digestion media and growth media
Penicillin G Potassium Salt MP Biomedicals 0219453680 – 100 MU Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C.
CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 x 20 mm) VWR 82050-598 For cell culture
Trypan blue Thermo Fisher Scientific T10282 For cell isolation
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056 For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 472301 For cell freezing media
Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001 For cell freezing
BD Vacutainer Red Plastic 10 ml Fisher Scientific 367820 For human serum collection
Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22ga x 1inch Needle Fisher Scientific 354221 For human serum collection
Thrombin, bovine origin Sigma-Aldrich T4648-1KU For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C.
Fibrinogen, bovine origin Sigma-Aldrich F8630-5G For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C.
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A3428 For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C.
6-Aminohexanoic acid Sigma-Aldrich 07260-100g For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4°C.
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960-5G Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C.
L-proline Sigma-Aldrich P5607-25G Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C.
Transforming growth factor-β1 Peprotech 100-21 Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20°C.
Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized EMD Millipore SCGPU02RE For reagent sterilization
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144-212 Dilute in water to 6M
4-Dimethylaminobenzaldehyde Sigma-Aldrich 39070-50g For hydroxyproline assay
Chloramine-T trihydrate Sigma-Aldrich 402869-100g For hydroxyproline assay
trans-4-Hydroxy-L-proline Sigma-Aldrich H54409-100g For hydroxyproline assay
1-propanol Sigma-Aldrich 279544-1L For hydroxyproline assay
Perchloric acid Sigma-Aldrich 311421-250ml For hydroxyproline assay
Acetic acid, glacial EMD Millipore AX0073-9 For hydroxyproline assay
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-500 For hydroxyproline assay
Toluene, anhydrous Sigma-Aldrich 244511-1L For hydroxyproline assay
Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-656 For hydroxyproline assay
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. West, D. W., et al. The exercise-induced biochemical milieu enhances collagen content and tensile strength of engineered ligaments. J Physiol. 593 (20), 4665-4675 (2015).
  2. Booth, F. W., Laye, M. J. Lack of adequate appreciation of physical exercise’s complexities can pre-empt appropriate design and interpretation in scientific discovery. J Physiol. 587 (Pt 23), 5527-5539 (2009).
  3. Booth, F. W., Hargreaves, M. Understanding multi-organ pathology from insufficient exercise. J Appl Physiol (1985). 111 (4), 1199-1200 (2011).
  4. Shearn, J. T., et al. Tendon tissue engineering: progress, challenges, and translation to the clinic. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 163-173 (2011).
  5. Liu, C. F., et al. What we should know before using tissue engineering techniques to repair injured tendons: a developmental biology perspective. Tissue Eng Part B Rev. 17 (3), 165-176 (2011).
  6. Vunjak-Novakovic, G., Altman, G., Horan, R., Kaplan, D. L. Tissue engineering of ligaments. Annu Rev Biomed Eng. 6, 131-156 (2004).
  7. Bayer, M. L., et al. The initiation of embryonic-like collagen fibrillogenesis by adult human tendon fibroblasts when cultured under tension. Biomaterials. 31 (18), 4889-4897 (2010).
  8. Guerquin, M. J., et al. Transcription factor EGR1 directs tendon differentiation and promotes tendon repair. J Clin Invest. 123 (8), 3564-3576 (2013).
  9. Ma, J., et al. Three-dimensional engineered bone-ligament-bone constructs for anterior cruciate ligament replacement. Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 103-116 (2012).
  10. Hagerty, P., et al. The effect of growth factors on both collagen synthesis and tensile strength of engineered human ligaments. Biomaterials. 33 (27), 6355-6361 (2012).
  11. Paxton, J. Z., Hagerty, P., Andrick, J. J., Baar, K. Optimizing an intermittent stretch paradigm using ERK1/2 phosphorylation results in increased collagen synthesis in engineered ligaments. Tissue Eng Part A. 18 (3-4), 277-284 (2012).
  12. Safdar, A., et al. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 4135-4140 (2011).
  13. Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
  14. Crane, J. D., et al. Exercise-stimulated interleukin-15 is controlled by AMPK and regulates skin metabolism and aging. Aging Cell. 14 (4), 625-634 (2015).
  15. Rao, R. R., et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis. Cell. 157 (6), 1279-1291 (2014).
  16. Aswad, H., et al. Exosomes participate in the alteration of muscle homeostasis during lipid-induced insulin resistance in mice. Diabetologia. 57 (10), 2155-2164 (2014).
  17. Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
  18. Maling, H. M., Stern, D. N., Altland, P. D., Highman, B., Brodie, B. B. The physiologic role of the sympathetic nervous system in exercise. J Pharmacol Exp Ther. 154 (1), 35-45 (1966).
  19. Pritzlaff, C. J., et al. Impact of acute exercise intensity on pulsatile growth hormone release in men. J Appl Physiol (1985). 87 (2), 498-504 (1999).
  20. Creemers, L. B., Jansen, D. C., van Veen-Reurings, A., van den Bos, T., Everts, V. Microassay for the assessment of low levels of hydroxyproline. Biotechniques. 22 (4), 656-658 (1997).
  21. Neuman, R. E., Logan, M. A. The determination of hydroxyproline. J Biol Chem. 184 (1), 299-306 (1950).
  22. Paxton, J. Z., Donnelly, K., Keatch, R. P., Baar, K., Grover, L. M. Factors affecting the longevity and strength in an in vitro model of the bone-ligament interface. Ann Biomed Eng. 38 (6), 2155-2166 (2010).
  23. Woessner, J. F. The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this imino acid. Arch Biochem Biophys. 93, 440-447 (1961).
  24. Paxton, J. Z., Wudebwe, U. N., Wang, A., Woods, D., Grover, L. M. Monitoring sinew contraction during formation of tissue-engineered fibrin-based ligament constructs. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1596-1607 (2012).
  25. Lee, C. A., et al. Estrogen inhibits lysyl oxidase and decreases mechanical function in engineered ligaments. J Appl Physiol (1985). 118 (10), 1250-1257 (2015).
  26. Paxton, J. Z., Grover, L. M., Baar, K. Engineering an in vitro model of a functional ligament from bone to bone. Tissue Eng Part A. 16 (11), 3515-3525 (2010).
  27. Heinemeier, K., Langberg, H., Kjaer, M. Exercise-induced changes in circulating levels of transforming growth factor-beta-1 in humans: methodological considerations. Eur J Appl Physiol. 90 (1-2), 171-177 (2003).
  28. Mackey, A. L., Heinemeier, K. M., Koskinen, S. O., Kjaer, M. Dynamic adaptation of tendon and muscle connective tissue to mechanical loading. Connect Tissue Res. 49 (3), 165-168 (2008).
  29. Psychogios, N., et al. The human serum metabolome. PLoS One. 6 (2), e16957 (2011).
  30. Nguyen, T., et al. The effects of resting and exercise serum from children with cystic fibrosis on C2C12 myoblast proliferation in vitro. Physiol Rep. 2 (6), e12042 (2014).
  31. Joyner, M. J., Pedersen, B. K. Ten questions about systems biology. J Physiol. 589 (Pt 5), 1017-1030 (2011).
  32. Joyner, M. J. Giant sucking sound: can physiology fill the intellectual void left by the reductionists?. J Appl Physiol (1985). 111 (2), 335-342 (2011).
  33. Benjamin, M., et al. Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites (‘entheses’) in relation to exercise and/or mechanical load. J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).
  34. Arruda, E. M., Calve, S., Dennis, R. G., Mundy, K., Baar, K. Regional variation of tibialis anterior tendon mechanics is lost following denervation. J Appl Physiol (1985). 101 (4), 1113-1117 (1985).
  35. Arendt, E., Dick, R. Knee injury patterns among men and women in collegiate basketball and soccer. NCAA data and review of literature. Am J Sports Med. 23 (6), 694-701 (1995).

Tags

LigamentExerciseNutritionSerumIn VitroIn VivoBrushite CementAnchorFibroblastsThrombinAprotininAminohexanoic Acid

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lee-Barthel, A., Baar, K., West, D. W. D. Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model. J. Vis. Exp. (124), e55339, doi:10.3791/55339 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image