本発明者らは、三次元構築物をヒトの運動調節血清で処理し、コラーゲン含有量、機能および細胞生化学について分析した靭帯組織のモデルを提示する。
インビトロ実験は、生物学的メカニズムを理解するために不可欠である。しかし、単層組織培養とヒトの生理との間のギャップは大きく、所見の翻訳はしばしば貧弱である。したがって、代替の実験的アプローチのための十分な機会がある。ここでは、ヒトの前十字靭帯組織の残骸からヒト細胞を単離し、培養を拡大し、人工靭帯を形成するために使用するアプローチを提示する。運動は、多くの組織、器官および身体過程の機能が改善されるように、血液中の生化学的環境を変化させる。この実験では、靱帯構築培地に、運動によって「調整された」実験的ヒト血清が補充された。このように、介入は、実験的組織が完全な内因性生化学的環境に曝露されるため、より生物学的に関連している。結合タンパク質および補助化合物には、関心のない未知のエージェント。治療後、操作された靱帯は、機械的機能、コラーゲン含有量、形態、および細胞生化学について分析することができる。全体として、伝統的な単層培養および動物モデル、ここで提示される靭帯組織の生理学的モデルに対する4つの大きな利点がある。第1に、靭帯構築物は三次元であり、極限引張応力、最大引張り荷重および弾性率などの機械的特性( すなわち機能)を定量化することを可能にする。第2に、ボーンと腱要素との間の境界であるエンテシスを、詳細かつ機能的な状況で検査することができる。第3に、運動後の血清を含む培地を調製することにより、運動の広範な健康上の利益を担う運動誘発生化学的環境の影響を偏りのない方法で調べることが可能になる。最後に、この実験モデルは、科学的研究を人道的かつ倫理的な方法で進歩させ、動物、国立衛生研究所の中心的任務、疾病管理センター、食品医薬品局(FDA)などが含まれます。
腱と靭帯の傷害は一般的であり、正常な運動性と生活の質に悪影響を与える可能性があります。外科的介入はしばしば必要であるが、限定された様々な成功をもたらすことができる4,5 。腱や靭帯がどのように発達し、成熟し、怪我に反応するかについての現在の理解は不完全であり、より効果的な治療法の開発についての洞察を提供するためには効果的な研究モデルが必要である5 。この知識のギャップに対処するために、動物モデルを使用することができるが、in vivo研究は本質的に複雑であり、環境を制御することおよび意図された組織への介入を直接標的とすることが困難である。対照的に、実験環境は、伝統的な単層細胞培養を用いてインビトロで容易に制御および監視することができる。しかしながら、この技術は化学的および機械的環境を単純化し過ぎる可能性があり、従って再現することはできない細胞のインビボ挙動の遅れを遅らせる。組織工学は、in vitro環境の制御と動物モデルにおける複雑なインビボ環境の利点と結びつくことができ、生理学を研究するための追加のツールを提供する。さらに、靭帯の発達の理解を武器に、組織工学は外科的再建が必要な場合に移植組織の源を提供する可能性があります。したがって、本明細書に記載される方法は、靭帯の機能および形態を研究するために使用され得るin vitroで操作される 3D組織を検証する。
フィブリンベースの腱または靱帯構築物は、コラーゲン原線維形成7および腱発生8ならびに移植組織としての有用性を前胸のヒツジモデルで評価した翻訳適用を含む生理学的過程を研究するためのインビトロモデルとして使用されているciate ligament(ACL)再建9 。私たちの研究室では、以前は、2つのブラシ石、リン酸カルシウム骨代替材料、セメントアンカーにまたがる3Dエンジニアリング靭帯モデルを確立しました。このモデルは、培養培地に生物学的因子10を補充するか、または機械的刺激11を適用するだけで、容易に異なる実験条件に供することができる。重要なことに、この骨 – 靭帯モデルは、怪我の影響を受けやすいボーンと腱の境界面である、エンセプションの詳細な分析を可能にします。
この方法論を提示するためにここで強調した1件の研究では、我々は靭帯機能に関する生化学的環境における運動誘発性変化の効果に興味があった。運動は、身体全体の様々な組織における細胞機能および器官機能を改善する2,3 、 </su様々な既知の(例えば、IL-6 13 、IL-15 14 、Meteorin様15 、エキソソーム16,17 )、および全身循環に放出される他の未知の生化学的因子の放出に起因し得る効果であるp> 。さらに、運動後の生化学的環境は、分泌腺( 例えば 、副腎18からのコルチゾールおよびカテコールアミン、および下垂体前葉19からの成長ホルモン)の交感神経系刺激によって放出される運動反応性ホルモンによって富化される)。しかし、 インビボでは、運動の機械的刺激の効果を運動誘発生化学的変化と区別することは不可能である。いくつかの研究では、エクササイズに応答する特定の循環ホルモンおよびサイトカインの予想される上昇を特徴付けているが前述のように、 インビトロで忠実に再現するには 、既知または未知の因子が多すぎます。すなわち、インビトロ研究のいくつかの因子を単離することは、生化学的応答の複雑さに十分に対応していない。本研究では、運動によって引き起こされた血清生化学的環境の変化が人工靭帯機能にどのように影響するかを調べた。生化学的変化の影響を分離するために、抵抗運動の前後前後でヒト参加者から血清を取得し、ヒト前十字靭帯(ACL)線維芽細胞を用いて形成された3D人工靭帯を治療するために使用した。このモデルを使用して、機械的特性およびコラーゲン含量への影響を含む機能的データを得ることができ、分子シグナル伝達への影響を定量化することができる。
本稿は、組織発達から翻訳/臨床的質問まで、幅広い研究テーマを持つ研究者にとって有用な実験プラットフォームである靭帯組織のモデルを記述している。ここで説明するエンジニアリングされた靭帯モデルは、ワークフローのさまざまな時点で適用可能な汎用プロトコルに基づいています( 図1およびディスカッションセクション )。さらに、 インビトロ環境の本質的に還元的な性質は、飼育培地にコンディショニングされたヒトまたは動物の血清を補充することによって、生理学的領域に近づけることができる。
構築物は、様々な供給源からの線維芽細胞を用いて形成することができる
ここに示された方法論および代表的な結果は、一次ACL線維芽細胞の使用に基づいているが、細胞単離プロトコルは、他のタイプの一次線維芽細胞を収集するために調整することができる。説明したように図4において、若いヒトドナーから単離された一次細胞で形成された人工靭帯は、低いドナー変動性を示す。一次細胞は、初期分離および通過制限によって制限される。細胞株の使用は実験の再現性を改善することができる。他の細胞タイプの使用は、細胞培養培地およびフィブリンゲル製剤の改変を必要とすることがある。例えば、我々は、ヒト間葉系幹細胞(MSC)が2週間にわたってブラシサイトセメントアンカー間に線状組織を形成することができないことを観察したが、ウマ上位デジタル屈筋腱線維芽細胞、ウマ骨髄間質細胞、ニワトリ胚腱線維芽細胞マウスC3H10T1 / 2 MSCは、フィブリンゲルを急速に収縮させて線状組織を形成する(未発表の観察)。このコントラストは、細胞収縮性、増殖および線維素溶解酵素産生の違いの結果であり得る。
化学薬品の適用および機械的刺激
本明細書に記載される方法では、フィブリンベースの組織がブルシャイトセメントアンカーの周りに形成され、ストレッチバイオリアクター11を介する機械的刺激の適用、並びにエンドポイント引張試験が可能になる。ブルサイトセメント – 軟組織界面(エントリー)の存在は、さらなる調査および改善の機会を提供する22,26(下記の臨床応用のセクションを参照)。このインビトロ環境では、化学的および機械的因子の寄与がより容易に同定され得る。これの一例が図5に示されており、それによって運動後の血清環境の効果が運動の機械的な刺激から分離された。実験的介入の時間枠、治療の組成、および観察可能な変化を期待するための適切なエンドポイントを決定するためにパイロット研究が必要な場合があります。フォ例えば、運動後の血清試験1では、実験的処置の長さは、培地を補うために使用される血清の供給によって制限され、そこから構築物は2日毎に栄養補給された。さらに、培養の2週間目に、培養培地にアスコルビン酸およびL-プロリンを維持したまま休止または運動後の血清を補充し、TGF-β1を除去した。 TGF-β1は、運動後に血清中に増加する既知の前線維増殖因子である27 。したがって、運動後血清のTGF-β1関連効果を不明瞭にするのを避けるために、このサイトカインは培地中に維持されなかった。
このエンジニアリングされた靭帯モデルは、機械的ストレッチの影響を試験するためにも使用することができる。ブルシャイトセメントアンカー端部( 図1に示す一軸引張試験機と同様)を保持するようにリバースモデルグリップを設計することにより、ストレッチバイオリアクターをeng ineered ligaments。私たちの研究室では以前、このモデルを使用して、イン・ビトロストレッチ・パラダイムの合理的な設計、あるいは潜在的にはイン・ビボでのより合理的な設計を提供する、カスタムメイドのバイオリアクター11における一軸引っ張りストレッチに対する人工靭帯の分子シグナル伝達応答を調べたストレッチ/活性/治療用途。
設計された靭帯の評価
伝統的な単層培養と同様に、3D構築物は遺伝子/タンパク質発現についてアッセイすることができる。さらに、それらの3D形態は、機能的および形態学的変化を評価する機会を提供し、構築物を長期間の研究のために培養液中で維持することができる( 図3 )。エンジニアリングされた靭帯は、天然の成熟した靭帯と同等ではないが、腱/靱帯の発達と類似しており、栄養素に応答して天然の組織と同様に挙動する従って、 インビトロモデルからの広範な一般化を行う前に注意が必要であるが、靭帯構築検査の結果は、そうでなければそうであるかもしれない特定の生理学的メカニズムを明らかにするか、または通知することができる。 in vivoで調べることは不可能です。
幅広い用途のフレキシブルでダイナミックなモデルのための条件付き血清を補給するための培地
ヒト血清メタボロームは、糖タンパク質、リポタンパク質、脂質誘導体、エネルギー基質、代謝産物、ビタミン、酵素、ホルモン、神経伝達物質、およびビルディングブロック/中間体の過多を含むが、これらに限定されない約4,500化合物の環境である。化合物クラス29によるヒト血清メタボロームのさらなる検査により、実験的血清をインビトロ実験に組み込むことの1つの利点がある。すなわち、血清中の〜4500の化合物の大部分は、疎水性または脂質由来であり、輸送/可溶化のための結合タンパク質の重要性を強調している。したがって、内因性化合物の輸送動態、したがってバイオアベイラビリティーおよび化合物 – 標的相互作用を実験的に要約することは、ほぼ不可能であろう。したがって、実験的血清は、可溶化、輸送、標的結合、および作用機序のためにアクセサリー分子に依存することが知られている化合物の研究に特に有効である。
私たちの研究室では、運動の健康上の利点に長い間関心があります。運動は、様々な要因(例えば、IL-6 13 、IL-15 14 、Meteorin-like 15など)に起因する可能性がある効果である、体12全体にわたる様々な組織における細胞機能および器官機能を改善する。エキソソーム16,17 )が、全身循環に放出される。運動後の生化学的環境は、骨格筋運動に応答するホルモンの収縮および分泌腺の交感神経刺激( 例えば 、副腎18由来のコルチゾールおよびカテコールアミン)の結果として放出される因子の両方から放出される因子を反映する下垂体前葉からのホルモン19 )。我々は最近、運動前および後の血清のモデルを用いて、運動誘発された生化学的環境が人工組織に及ぼす影響を調べた。多くの重要な運動関連の研究課題が残っているが、このモデルは決してこのように限定されるものではない。例えば、食物または薬理学的介入後、または異なる年齢群または臨床集団からの動物またはヒトの供給源から血清を得ることができたs 30 。このようにして、目的の外因性または内在性の化合物は、生物学的利用可能な量で血清および処理媒体中に存在し、内因性環境と協調して( すなわち 、より生理学的な状況において)標的組織と相互作用する。このアプローチは、与えられた介入が多臓器(および多化合物)効果を発揮する可能性が高く、したがって生理学的環境が共同修正される可能性が高いため、動的アプローチである。このアプローチはある種の課題を提示するが、複数の全身生化学的変数が同時に変更されるため、純粋に還元的な実験方法論31,32の欠点を克服するのに役立つアプローチである。まとめると、組織工学処理された( 生体外生体模倣 )組織と共に条件付き血清を実施することは、生理学、栄養および臨床研究の質問のためのツールとして使用することができる。
<strong>臨床応用は数多くあります
ここに示した組織工学モデルは、伝統的なインビトロモデルでは不可能な解剖学的および臨床研究の問題を調査するために使用できます。 インビボの靱帯または腱は 、エントレと呼ばれる軟組織から硬組織への移行領域を含む。機械的ストレスに関連した損傷33に対して脆弱なenthesisは、組織化学的および電子顕微鏡法22,26を介して断面で研究することができる。物理的な不活動は結合組織が低〜高コンプライアンス34の領域に負荷を伝達する能力を損ない、最終的に組織コンプライアンスの全体的な低下および傷害リスクの増大を招くため、この独特の界面は運動性が低いまたは拘束されていない人にとって二重に重要である。
私たちの研究室では最近、この組織工学モデル25 <他の集団、女性の運動選手、結合組織損傷の危険性があるモデル:ACL傷害の発生率は、男性の約35倍です。生理的濃度の女性ホルモンであるエストロゲンを用いて靭帯構築物を月経周期の段階を模倣した濃度で処置することにより、この性別に基づく負傷の根底にある可能性のあるメカニズムを調べた。興味深いことに、高濃度のエストロゲンは、靭帯および腱のコラーゲンマトリックス中にリジン – リジン架橋を形成する一次酵素であるlys1オキシダーゼの遺伝子発現および活性を阻害した。重要なことに、48時間の高エストロゲン(卵胞期をシミュレートする)は、構築物のコラーゲン密度を変えずに靭帯構築物の剛性を減少させた。生理学的観点から、これは、女性における靭帯の弛緩の増加が、少なくとも部分的には、クロスリンク形成。実験的な観点から、これらの知見25は、機能的架橋結合活性を調べることができる3D構築物モデルの有用性を強調している。臨床的観点から、このモデルは、靭帯機能のエストロゲンの負の影響を防ぐことができる介入を迅速にスクリーニングするために使用できるようになりました。
閉会の言葉
ここでは、設計された靭帯の形成のための詳細な方法論と3D インビトロ組織モデルとしてのそれらの有用性を提示した。このモデルは幅広い目的に非常に適応し、細胞タイプ、介入、および目的の結果尺度の柔軟性を提供する。調整された血清を含む飼料培地を補充すると、伝統的なインビトロ環境では達成できない生理学的状況が加わり、 インビボ生理学のモデリングが改善される 。つまり、これは広く適用可能なモードであると考えています生理学と組織工学の両方の分野をさらに発展させるための刺激的な意味合いを持っています。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、NSERCのポスドク研究員(DWDW)、ARCS財団奨学生(AL)、およびUC Davis College of Biological Sciences助成金(KB)によって支援されました。
Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20 | Entomoravia | N/A | For brushite cement anchors; include info on multiple sources and alternative products |
β-tricalcium phosphate | Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK) | N/A | For brushite cement anchors; include whether it's hazardous /toxic |
o-phosphoric acid, 85% (w/w) | EMD Millipore | PX0995 | For brushite cement anchors; include info on preparation |
Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500g | For brushite cement anchors |
Falcon 35mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772A | For silicone-coated plates |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | For silicone-coated plates |
1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | SH3002802 | For cell isolation and expansion |
100X antibiotic/antimycotic solution | VWR | 45000-616 | For cell isolation |
Type II collagenase | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | For cell isolation |
100X penicillin/streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For cell isolation |
Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated | EMD Millipore | SCGP00525 | For reagent sterilization |
DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine | VWR | 10-013-CV | For cell and tissue culture |
Fetal bovine serum | BioSera | FBS2000 | Component of tissue digestion media and growth media |
Penicillin G Potassium Salt | MP Biomedicals | 0219453680 – 100 MU | Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C. |
CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 x 20 mm) | VWR | 82050-598 | For cell culture |
Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | For cell isolation |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | For cell freezing media |
Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | For cell freezing |
BD Vacutainer Red Plastic 10 ml | Fisher Scientific | 367820 | For human serum collection |
Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22ga x 1inch Needle | Fisher Scientific | 354221 | For human serum collection |
Thrombin, bovine origin | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
Fibrinogen, bovine origin | Sigma-Aldrich | F8630-5G | For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A3428 | For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
6-Aminohexanoic acid | Sigma-Aldrich | 07260-100g | For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4°C. |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C. |
L-proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C. |
Transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20°C. |
Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized | EMD Millipore | SCGPU02RE | For reagent sterilization |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | Dilute in water to 6M |
4-Dimethylaminobenzaldehyde | Sigma-Aldrich | 39070-50g | For hydroxyproline assay |
Chloramine-T trihydrate | Sigma-Aldrich | 402869-100g | For hydroxyproline assay |
trans-4-Hydroxy-L-proline | Sigma-Aldrich | H54409-100g | For hydroxyproline assay |
1-propanol | Sigma-Aldrich | 279544-1L | For hydroxyproline assay |
Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421-250ml | For hydroxyproline assay |
Acetic acid, glacial | EMD Millipore | AX0073-9 | For hydroxyproline assay |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | For hydroxyproline assay |
Toluene, anhydrous | Sigma-Aldrich | 244511-1L | For hydroxyproline assay |
Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-656 | For hydroxyproline assay |