Summary

Biosensing Motor Neuron Membraan Potentieel in Live Zebrafish Embryo's

Published: June 26, 2017
doi:

Summary

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Abstract

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos.

Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Introduction

In vivo systeemanalyse analyse maakt wetenschappers in staat om cellulaire gedrag op de meest betrouwbare manier te onderzoeken. Dit is vooral waar wanneer de onderzochte activiteit sterk beïnvloed wordt door cel-cel interacties (zowel contact- als niet-contactafhankelijk), zoals in het zenuwstelsel, waarbij membraanspanning verandert de communicatie onder excitabele cellen. Het begrip van de informatie die door deze elektrische signalen wordt gecodeerd, is de sleutel tot het begrijpen van de manier waarop het zenuwstelsel in zowel fysiologische als ziektestaten werkt.

Om cellulaire elektrische eigenschappen te bestuderen in de meest niet-invasieve fysiologische omstandigheden, zijn verscheidene genetisch gecodeerde spanningsindicatoren recentelijk ontwikkeld 1 . In tegenstelling tot de vorige generaties optische spanningsensoren (voornamelijk spanningsgevoelige kleurstoffen) 2 , bieden GEVI's in vivo analyses van het intacte neurale systeem enHun expressie kan worden beperkt tot specifieke celtypen of populaties.

Het embryo van de zebravis is het in vivo "substraat" van de keuze om te profiteren van het grote potentieel dat aan GEVI's wordt toegeschreven. Dankzij zijn optische helderheid en zijn vereenvoudigde, maar evolutionair geconserveerde zenuwstelsel, maakt het zebravismodel de identificatie en manipulatie van elke cellulaire component in een netwerk eenvoudig. De werkgelegenheid van de FRV-GEVI-zeemeermin 3 leidde immers tot het identificeren van pre-symptomatische veranderingen in het spinale motorische neurongedrag in een zebravismodel van amyotrofe laterale sclerose (ALS) 4 .

Het volgende in vivo protocol beschrijft hoe de elektrische eigenschappen van spinale motorische neuronen in intacte zebravis embryo's op een neuronale manier worden uitgedrukt. Bovendien toont het aan hoe farmacologisch geïnduceerde chanGes in dergelijke elektrische eigenschappen kan worden geassocieerd met veranderingen in de frequentie van embryonale spontane spoelingen, de stereotype motorische activiteit die het bewegingsgedrag van de zebravis in zeer vroege ontwikkelingsstadia kenmerkt.

Protocol

1. pHuC_Mermaid Plasmid Generation OPMERKING: Zeemeermin is een biosensor die is ontwikkeld door het spanningswaarnemende domein (VSD) van de Ciona intestinalis te koppelen (nu Ciona robusta ) 5 spanningssensor die fosfatase (Ci-VSP) bevat met de FRET-partner fluorophoren Umi-Kinoko Green (mUKG: donor) en een monomere versie van het oranje-emitterende fluorescerende eiwit Kusabira Orange (mKOk: acceptor). Voor deze biosensor verhogen conform…

Representative Results

Een expressievector die de FRET-gebaseerde zeemeermin biosensor coderende sequentie draagt ​​onder de controle van de pHuC pan-neuronale promotor, die de synthese van het eiwit uitsluitend in het zenuwstelsel drijft, werd afgeleverd in enkelvoudige bevruchte eieren door middel van een microinjectie in Om transiente transgene embryo's te verkrijgen ( Figuur 1 , Linker paneel). Na het masteren van de microinjectietechniek was het percentage zeeme…

Discussion

Het hier gepresenteerde protocol liet ons de associatie tussen de elektrische eigenschappen van embryo-spinale motorische neuronen en de spontane coilgedrag, de vroegste stereotiepe motoractiviteit, ongeveer 17 pk. Van embryonale ontwikkeling verkennen en duurt tot 24 pkf 10 .

Onze aanpak biedt onderzoekers een instrument om het neurale systeem van intacte embryo's te bestuderen, waarbij de complexiteit van de interacties tussen cellen in een ontwikkelend function…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Simona Rodighiero for her priceless support with the FRET imaging analysis.

Materials

Low Melting Point Agarose  Sigma-Aldrich A9414
DMSO  Sigma-Aldrich W387520
Riluzole Sigma-Aldrich R116
Pfu Ultra HQ DNA polymerase  Agilent Technologies – Stratagene Products Division 600389
T3 Universal primer  Sigma-Aldrich
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system Promega A9280
Universal SmaI primer  Eurofins
StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector  Agilent Technologies – Stratagene Products Division  240228
SmaI  New England Biolabs R0141S
T4 DNA ligase Promega M1801
SalI New England Biolabs R0138S
EcoRV New England Biolabs R0195S
35 mm, glass-bottomed imaging dish  Ibidi 81151
forceps Sigma-Aldrich F6521
Stereomicroscope Leica Microsystems M10 F
Digital camera Leica Microsystems DFC 310 FX
Leica Application Suite 4.7.1 software  Leica Microsystems
QuickTime Player, v10.4 Apple
Confocal microscope (inverted) Leica Microsystems TCS SP5
Microinjector  Eppendorf  Femtojet
ImageJ macro Biosensor_FRET 
GraphPad Prism 6.0c  GraphPad Software, Inc

References

  1. Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
  2. Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
  3. Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
  4. Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515 (2016).
  5. Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879 (2015).
  6. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
  7. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
  8. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  9. Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
  10. Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
  11. Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
  12. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
  13. Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566 (2016).

Play Video

Cite This Article
Benedetti, L., Ghilardi, A., Prosperi, L., Francolini, M., Del Giacco, L. Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (124), e55297, doi:10.3791/55297 (2017).

View Video