網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-Seq
Summary
ここでは、単離の前、およびその後の単一細胞転写物の特徴付けのために、ニューロン細胞タイプを分類するためのコンビナトリアルアプローチを提示する。このプロトコルは、RNAシーケンシング（RNA-Seq）のためのサンプルの調製を最適化し、細胞多様性の強化された理解のために特別に設計された方法論を記載する。
Abstract
細胞タイプ特異的マーカーの発見は、細胞機能および細胞異種起源の洞察を提供することができる。近年、ニューロンの多様性の理解を促進するために、発現が細胞の様々な亜集団を定義する遺伝子を同定することが重要である。網膜は、中枢神経系の多様性の研究のための優れたモデルとして機能する。なぜなら、それは複数の主要な細胞タイプから構成されているからである。各主要クラスの細胞の研究により、これらの集団の同定を容易にする遺伝子マーカーが得られた。しかし、これらの主要な網膜細胞クラスのそれぞれには、複数のサブタイプの細胞が存在し、これらのサブタイプのほとんどは、形態マーカーまたは機能によって特徴付けられているが、遺伝マーカーは知られていない。個々の網膜サブタイプの遺伝マーカーの知識は、特定の視覚機能に関連する脳標的の研究およびマッピングを可能にし、また、その遺伝子ネットワークに洞察を与えることができる細胞の多様性を維持する。サブタイプの遺伝子マーカーを同定するために使用される現在の手段は、配列決定後の細胞型の分類などの欠点を有する。これはデータ分析の課題であり、クラスタに同じ機能のセルが確実に含まれるように厳密な検証方法が必要です。本発明者らは、単離および配列決定の前に細胞の形態および機能性を同定するための技術を提案し、これはサブタイプ特異的マーカーの同定を容易にする。この技術は、神経細胞以外の細胞型だけでなく、細胞の稀少な集団にも及ぶ可能性があります。このプロトコルは、数多くのライブラリが単一セルに対して2000万回以上の読み取り深度を提供しているので、優れた品質のデータをもたらします。この方法論は、単一細胞RNA-Seqによって提示される多くのハードルを克服し、直接的かつ非常に効率的な方法で細胞型をプロファイルすることを目指す研究者に適している可能性がある。
Introduction
ニューロンの多様性は、中枢神経系、特に網膜前駆細胞1,2,3の1つの集団から生じる1つの神経膠細胞型および6つのニューロン細胞タイプからなる高度に特殊化された組織である脊椎動物網膜において観察される。細胞の多くのサブタイプは、機能的、形態学的および遺伝的に分類することができる。このプロトコールの目的は、細胞型の遺伝的変異性をそれらの同定可能な機能的および/または形態学的特徴と結びつけることである。多くの遺伝子が細胞の分類のために同定されているが、多くの亜型は、全体集団のわずかな部分しか表さないので、特徴付けされていない。これらの特定のサブタイプ内の遺伝子の同定は、網膜内のニューロンの多様性のより大きな理解を可能にし、また、他の場所での神経細胞の多様化を明らかにする可能性がある。フーさらに、単細胞研究は、全細胞集団のうちの低い発現のために見過ごされた可能性のある新しい細胞タイプの発見を可能にする。4,5,6,7。
単一細胞トランスクリプトミックスの利点の1つは、特定の細胞亜型を定義する独特のマーカーまたはマーカーの組み合わせが発見され得ることである。これらは、異なる操作のためにその細胞型に遺伝的にアクセスするために使用することができます。例えば、我々は、このプロトコールを使用して、光色素メラノプシンを発現する網膜神経節細胞のサブセットの細胞型特異的遺伝子を特徴づける。メラノプシン発現網膜神経節細胞における蛍光マーカーの使用は、既知の遺伝子の発現のために一緒に集まっているので、これらの細胞の研究を可能にする。興味深いことに、この細胞集団の5つの既知のサブタイプが存在するマウスの網膜8にある。したがって、各タイプの細胞からRNAを単離するために、トランスジェニックモデル内に確立された形態学的分類を使用して、細胞分離の前に各サブタイプを同定した。この技術は、細胞内のストレス応答と切断された樹状突起によるコンタミネーションを引き起こす可能性のある組織の解離を必要とせずに、細胞の特徴付けと網膜からの直接的な分離を可能にする。
RNA-Seq法が発展しているので、ここ数年の間に数多くの新しい技術が明らかになりました。これらのツールは、手作業4,7,10,11,12,13の問題に近づいている間に、最大の細胞獲得とより高いコスト効率を可能にします。しかし、これらの技法は優れた踏み台になっていますが、このプロトコルが対応できる多くのハードルがあります。第1に、現在の手順の多くは、解離した組織から細胞を単離し、主成分分析または事後的な階層的クラスタリングのいずれかを用いて細胞分類を決定しようと試みる。これらのツールを使用してサブタイプを分類することは、信頼できる結果をもたらさない可能性があり、遺伝子マーカーと機能的細胞タイプとの相関についてこのデータを検証する新しい方法を見つけ出す可能性があります。他のプロトコールでの解離の必要条件は、組織損傷を引き起こし、神経突起を切断してmRNAの潜在的な消失を引き起こすことがある。さらに、解離した細胞調製物において、ストレス応答は、これらの細胞の転写物に影響し始める可能性がある14 。このプロトコルは、分離の前に機能的細胞型を決定することによってこれらの課題を克服し、h網膜組織を無傷に保つことによって細胞の恩恵を受ける。
1つの手法が2014年に導入され、生きた細胞のトランスクリプトームのインビボ分析で構成されていました15 。この技術は、組織への機械的破壊を最小限に抑えてトランスクリプトームの検査を可能にするが、非常に特異的なレポーターマウスを用いることなくトランスクリプトームを調べる前に組織内の特定の細胞型を分類する能力が欠けている。私たちのプロトコールでは、特定のレポーターは必要ありません。細胞を分離して分離する前に、細胞の充填と電気生理学を利用するためです。この以前のプロトコールのもう一つの制限は、光活性化可能なエレメントを励起するために特定の波長を必要とするということであるが、我々のプロトコールは、容易に入手可能であるかまたは各ラボで個別に選択できる蛍光レポーターおよび蛍光染料の使用を可能にする。それでもなお、他の研究所は、電気の2つの方法細胞多様性研究のための生体生理学およびトランスクリプトミクス。分離の前に細胞の機能を特徴づけるためのパッチクランプ記録の使用は、解離したニューロン16で実施され、場合によっては、これらの研究のためにマイクロアレイ分析17の使用に先行していた。それらが組織解離または利用可能なプローブへの試料のハイブリダイゼーションに依存するマイクロアレイ技術の使用を必要とするので、それらのアプローチによって同じ合併症が生じる。最新の進歩の1つは、パッチクランプ記録とRNA-Seq技術を組み合わせて全脳スライス18の細胞を理解するPatch-Seqの開発です。この手法はここに提示されたプロトコールと類似していますが、我々のアプローチでは、細胞の健康のために組織を無傷のままにすることができます。ここでは、最適化のためのプロトコルを提示するこれはRNA-Seqを使用して高い読み取り深度とマッピングカバレッジを得るための高品質の単一細胞ライブラリーを生成します。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々のプロトコールは、迅速で使い易いガイドを通して、標本に対する傷害をほとんど起こさずに、高品質の配列決定のために同定された形態学的クラスの単一細胞を調製する方法を実証する。現在の原稿では、本質的に感光性の網膜神経節細胞を形態学的に特徴付け、単離し、RNA-Seqについて調製する。細胞のストレスは、網膜の取り扱い中に起こり得る。このため、4時間以内に各組織を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、Jennifer BairとEinat SnirならびにIowa Institute for Human Geneticsがサンプルの調製と取り扱いを支援したことを認めたいと思います。
Materials
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Petri dish (35mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
| 1mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 ml PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
| Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
| Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
| MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
| 1.5 ml MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
| 10X Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
| 5X Ultra Low First-Strand Buffer | Buffer 1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
| SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
| SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase | ||
| 2X SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
| PCR Primer II A | PCR Primer | ||
| SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
| TD Buffer | Buffer 2 | ||
| ATM | Tagmentation Mix | ||
| NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
| NPM | PCR Master Mix | ||
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
| N501 | White 1 | ||
| N502 | White 2 | ||
| N701 | Orange 1 | ||
| N702 | Orange 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |
References
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