Single-cell RNA-Seq van gedefinieerde subsetjes van retinale Ganglion-cellen

Neuronale diversiteit wordt waargenomen in het centrale zenuwstelsel, in het bijzonder in het vertebrate retina, een zeer gespecialiseerd weefsel dat bestaat uit 1 glial- en 6 neuronale celtypen die voortvloeien uit een populatie van retinale voorlopercellen ^{1 , 2 , 3} . Veel subtypes van cellen kunnen functioneel, morfologisch en genetisch worden ingedeeld. Het doel van dit protocol is om de genetische variabiliteit van celtypen te binden aan hun identificeerbare functionele en / of morfologische eigenschappen. Er zijn een aantal genen geïdentificeerd voor de indeling van cellen, maar veel subtypes blijven ongekarakteriseerd, aangezien zij een kleine fractie van de totale populatie vertegenwoordigen. De identificatie van genen binnen deze specifieke subtypes zal een groter begrip van de neuronale diversiteit in het netvlies mogelijk maken en kan ook de diversificatie van neurale cellen elders schuiven. FuDaarnaast kunnen single-cell studies de ontbinding van nieuwe celtypes toestaan, die kunnen worden over het hoofd gezien door hun lage representatie onder de totale populatie ^{4 , 5 , 6 , 7} .

Een van de voordelen van single-cell transcriptomics is dat unieke markers of combinaties van markers die een bepaald cellulaire subtype definiëren, ontdekt kunnen worden. Deze kunnen dan gebruikt worden om genetische toegang te krijgen tot dat celtype voor verschillende manipulaties. Bijvoorbeeld, we gebruiken dit protocol om de celtype-specifieke genen van een subset van retinale ganglioncellen die de fotopigment melanopsin uitdrukken, te karakteriseren. Het gebruik van een fluorescerende marker in melanopsine-expressie-retinale ganglioncellen maakt het mogelijk om deze cellen te bestuderen, aangezien ze samen worden geclusterd door hun expressie van een bekend gen. Interessant genoeg zijn er vijf bekende subtypen van deze cel popuLatie in het muisnetje ⁸ . Dus, om RNA van cellen van elk type te isoleren, hebben we gevestigde morfologische classificaties binnen het transgene model gebruikt om elk subtype voorafgaand aan celisolatie te identificeren. Deze techniek zorgt voor de karakterisering van cellen alsook voor hun isolatie rechtstreeks van het retina, zonder dat er een weefseldissociatie nodig is, wat een stressrespons binnen cellen kan veroorzaken en besmetting door afgescheiden dendrieten ⁹ .

In de afgelopen jaren is een groot aantal nieuwe technieken aan het licht gekomen, aangezien de RNA-Seq-methode verder ontwikkelt. Deze hulpmiddelen maken het mogelijk om een ​​maximale celverwerving te verkrijgen en een grotere kosten-efficiëntie, terwijl u de vraag ^{4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13} nadert. Echter, terwijlDeze technieken zijn uitstekende stepping stones, er zijn nog steeds een aantal hindernissen die dit protocol kan adresseren. Ten eerste isoleren veel van de huidige procedures cellen uit gedissocieerd weefsel en proberen om hoofdcomponentanalyse of hiërarchische clustering posthoc te gebruiken om de celclassificatie te bepalen. Vertrouwen op deze hulpmiddelen om subtypes te classificeren, kan geen betrouwbare resultaten opleveren en kan een dwingen om nieuwe manieren te vinden om deze gegevens te valideren voor de correlatie van een genetische marker naar een functioneel celtype. De vereiste voor dissociatie in andere protocollen kan soms weefselschade veroorzaken en kunnen neuronale processen scheiden, waardoor een mogelijk verlies van mRNA kan ontstaan. Bovendien kunnen in de gedissocieerde celpreparaten de stressresponsen beginnen de transcriptomen van deze cellen ^{14 te} beïnvloeden. Dit protocol overwint deze uitdagingen door het functionele celtype voorafgaand aan isolatie te bepalen en het handhaaft het beterGezondheid van de cellen door het retinale weefsel intact te houden.

Een techniek werd in 2014 geïntroduceerd en bestond uit de in vivo analyse van het transcriptoom van levende cellen ¹⁵ . Hoewel deze techniek het onderzoek van het transcriptoom met minimale mechanische verstoring van het weefsel mogelijk maakt, ontbreekt het de mogelijkheid om specifieke celsoorten in het weefsel te classificeren alvorens hun transcriptomen te onderzoeken zonder gebruik te maken van een zeer specifieke reportermuis. Ons protocol heeft geen specifieke reporter nodig, omdat we celvulling en elektrofysiologie gebruiken om cellen te karakteriseren voor hun isolatie. Een andere beperking van dit vorige protocol is dat het een specifieke golflengte nodig heeft om het foto-activeerbare element op te wekken, terwijl ons protocol het mogelijk maakt om een ​​fluorescerende reporter en fluorescerende kleurstof te gebruiken die gemakkelijk verkrijgbaar zijn of per laboratorium afzonderlijk kunnen worden gekozen. Nog steeds hebben andere laboratoria getrouwd met de twee methoden van electrOphysiologie en transcriptomics voor de studie van cellulaire diversiteit. Het gebruik van patch-klemopnamen om de functie van een cel voorafgaand aan zijn isolatie te karakteriseren is uitgevoerd op gedissocieerde neuronen ¹⁶ en in sommige gevallen is het voorafgegaan door het gebruik van microarray analyse ¹⁷ voor deze studies. Dezelfde complicaties worden ondervonden door deze benaderingen, aangezien ze weefseldissociatie of het gebruik van microarray technologie nodig hebben, die afhankelijk is van de hybridisatie van monsters naar beschikbare probes. Een van de meest recente ontwikkelingen is de ontwikkeling van Patch-Seq, een techniek die het gebruik van patch-clamp-opnamen en RNA-Seq-technologie combineert om cellen van hele hersenschijfjes 18 te begrijpen. Hoewel deze techniek haar overeenkomsten heeft met het hier gepresenteerde protocol, is het opnieuw belangrijk om op te merken dat onze aanpak het in staat stelt om het weefsel intact te houden voor de gezondheid van de cellen. Hier presenteren wij een protocol voor de optimizatIon van deze alliantie, die hoge kwaliteit, single-cell bibliotheken voor het gebruik van RNA-Seq genereert om een ​​hoge leesdiepte en mapping dekking te verkrijgen.