海洋細菌の生態毒性学的方法<em> Vibrio anguillarum</em>環境汚染物質の急性毒性を評価する

1.試薬/材料の調製細菌懸濁液の連続希釈のための滅菌1.5 mLチューブ（約300個）と、試験濃度で標識された試験容器としての15 mL滅菌チューブを準備する。 暴露培地として2％NaCl溶液を調製し、それを滅菌する。あるいは、塩分が5〜40の滅菌合成海水または天然海水を使用してください。 ラベルの指示に従って2％NaClを含むトリプシン大豆寒天培地（TSA）を培地に調製し、培地中に既に存在するNaClの量を考慮する。 試験濃度および暴露時間、反復回数、および希釈係数で予め標識した90mmペトリ皿にTSA（冷たいが液体のまま）を注ぎ、 19 mLが適切な容量です。 ラベルの指示に従ってトリプシン大豆ブロス（TSB）増殖培地を調製する。適切な量​​のNaClを加えて、暴露培地と同じ塩分を得る。 準備する二重蒸留水を用いてCuSO 4ストック溶液を調製し、0.22μmのシリンジフィルターを使用して（必要な）アリコートを滅菌する。環境サンプルの場合は、適切な希釈間隔でサンプルを調製し、0.22μmシリンジフィルターを使用してサンプルを滅菌します。 試験濃度で標識された15 mLチューブに試験溶液を調製する。ネガティブコントロールを5 mLの暴露培地（2％NaCl）で満たします。他の試験管に適切な量の暴露培地とCuSO 4原液を満たし、最終濃度5 mLの試験濃度を得る。 2.細菌接種物の調製試験の12〜18時間前に、 Vibrio anguillarumの液体の新鮮な培養液を調製する。滅菌ループを使用して、固体培地（TSA）上で一晩培養した単離した単離コロニーを選択する。 10mLのTSBで満たされたチューブに接種し、細菌培養物を25℃で12〜18時間インキュベートする。 </li> 12〜18時間後、接種材料の細菌濃度を分光光度的に推定する。接種材料をボルテックスし、TSBをブランクとして600 nm波長で光学密度を測定する。 既知の細菌濃度を得るために、この式で計算したTSBの量を添加することによってボルテックスした接種材料2mLを希釈する： TSBmL = [（OD / 0.14）* 2] -2。 希釈した接種材料の光学密度が0.140（±0.005）であることを確認します。これは、McFarland比濁標準の0.5ポイントに相当します。 希釈した接種材料を3,000gで10分間遠心分離する。上清を除去し、微生物ペレットを1mLの2％NaCl溶液（暴露培地）に再懸濁する。 3.露出のテストコントロールを含む各チューブに再懸濁した細菌接種材料150μLを添加する。 V. anguillarum懸濁液を25℃で6時間、暗黒下でインキュベートし、連続して沈降を避けるために振とうする。 暴露時間の開始（T 0 ）および終了（T 6 ）に、コロニー形成単位（CFU）計数法を用いて、全ての暴露された細菌懸濁液中で細菌計数を行う。 10倍希釈係数（10 -5まで）を適用して、各曝露された細菌懸濁液の連続希釈物を三重に調製する。 900μLの暴露培地（2％NaCl）で既に満たされた対応するチューブに100μLの各細菌懸濁液を加える。連続希釈を続け、各段階でボルテックスして細菌を再懸濁する。 対応するセグメントのTSAペトリ皿上に10 -4および10 -5希釈物10μLをプレートする。プレートを回転させることで、小さな円をすばやく滑らせます。プレートを25℃で48時間インキュベートする。 CFUカウンティング 48時間後、ペトリ皿上で増殖したコロニーを数え、 bを含むプレート正確な計数には5〜50コロニーが最適です。 以下の式を適用して、各曝露された細菌懸濁液のmL当たりの生菌数を計算する： 10 -4 →CFU / mL = n°CFU×100×10,000 10 -5 →CFU / mL = n°CFU×100×100,000 対照と比較して死亡率を評価するために、平行反復で得られたカウントの平均を用いる。死亡率をパーセンテージとして次の公式で計算します。 M％= 100 – [（N / C）×100] 注：N =毒性物質に暴露した後に生育したCFU / mLの数。 C =対照培地中で増殖したCFUの数。 適切な統計ソフトウェア（材料表参照）を用いた非線形回帰分析により、LC 50 （ すなわち、活発に複製する細菌の数をmL当たり50％減少させる毒性物質の濃度; CFU / mL）を計算する。一方向分散分析（ANOVA）を実行する事後的なペアワイズt検定により、治療間の有意差を評価した。