طريقة السمية البيئية مع البكتيريا البحرية<em> فيبريو أنغيلاروم</em> لتقييم السمنة الحادة من الملوثات البيئية
Summary
ويصف هذا العمل بروتوكولا جديدا لتقييم السمية الإيكولوجية للملوثات، بما في ذلك الملوثات الناشئة مثل المواد النانوية، باستخدام البكتيريا البحرية فيبريو أنغيلاروم . هذا الأسلوب يسمح لتحديد لك 50 ، أو معدل الوفيات، والتركيز الذي يسبب انخفاض بنسبة 50٪ في استزراع البكتيريا، بعد التعرض لمدة 6 ساعات.
Abstract
البكتيريا هي عنصر هام في النظام الإيكولوجي، ويمكن أن يكون للتغييرات الميكروبية المجتمع تأثير كبير على الدراجات الكيميائية الحيوية والبيولوجية الشبكات الغذائية. اختبار السمية على أساس الكائنات الحية الدقيقة وتستخدم على نطاق واسع لأنها سريعة نسبيا، وقابلة للتكرار، ورخيصة، ولا ترتبط مع القضايا الأخلاقية. هنا، وصفنا طريقة السمية البيئية لتقييم الاستجابة البيولوجية من البكتيريا البحرية فيبريو أنغيلاروم. وتقيم هذه الطريقة السمية الحادة للمركبات الكيميائية، بما في ذلك الملوثات الجديدة مثل الجسيمات النانوية، وكذلك العينات البيئية. نقطة النهاية هي الحد من الاستزراع البكتيري ( أي القدرة على تكرار وتشكيل المستعمرات) بسبب التعرض لسموم. ويمكن الإشارة إلى هذا التخفيض عموما على أنه معدل الوفيات. يسمح الاختبار لتحديد لك 50 ، والتركيز الذي يسبب انخفاض 50٪ من البكتيريا تكرار بنشاط وتشكيل المستعمرات، بعدتعرض لمدة 6 ساعات. يتم حساب البكتيريا المستزرعة من حيث وحدات تشكيل المستعمرة (كفو)، ويتم تقييم "الوفيات" ومقارنتها مع عنصر التحكم. في هذا العمل، تم تقييم سمية كبريتات النحاس (كوسو 4 ). وقد لوحظ وجود علاقة واضحة للجرعة والاستجابة، مع متوسط 50 لك من 1.13 ملغم / لتر، بعد ثلاثة اختبارات مستقلة. هذا البروتوكول، بالمقارنة مع الطرق القائمة مع الكائنات الحية الدقيقة، ينطبق في مجموعة واسعة من الملوحة وليس لديه قيود على عينات ملونة / عكر. ويستخدم محلول ملحي كوسيلة التعرض، وتجنب أي تدخلات ممكنة من وسط النمو مع الملوثات التحقيق. ويسهل حساب لك 50 المقارنات مع المقايسات البيولوجية الأخرى التي تطبق عادة على التقييمات البيئية السمية للبيئة البحرية.
Introduction
تقيم المقايسات الحيوية السمية البيئية سمية المواد الكيميائية أو العينات البيئية مع النماذج البيولوجية القياسية، وتدمج آثار الضغوطات الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية على النظم الإيكولوجية. ونظرا لتعقيد النظم الإيكولوجية، يجب أن تأخذ تقييمات المخاطر الإيكولوجية السمعية في الاعتبار مجموعة من الاختبارات البيولوجية التي تنطوي على كائنات حية من مستويات غذائية مختلفة. قد تكون مقايسات السمية على الحيوانات المختبرية مكلفة، وتستغرق وقتا طويلا، ومساءلة أخلاقيا. إن حملة الحد من التجارب على الحيوانات ووضع نهج بديلة (على سبيل المثال، على البكتيريا والحيوانات غير الفقارية) هي الآن قضية محورية، كما ورد في إطار التشريع الأوروبي الحالي، بما في ذلك توجيه حماية الحيوان للاتحاد الأوروبي، والتعديل السابع ل وتوجيه الاتحاد الأوروبي مستحضرات التجميل، و ريتش.
وتستخدم القشريات والأسماك والطحالب إلى حد كبير في قياسات السمية في البيئة البحرية 1 . البكتيريا هي كومبونين هامطن من النظام الإيكولوجي، والتغييرات في المجتمعات الميكروبية يمكن أن يكون لها آثار كبيرة على ركوب الدراجات البيوكيميائية وغيرها من خدمات النظم الإيكولوجية الحرجة. اختبار السمية على أساس الكائنات الحية الدقيقة تكتسب شعبية لأنها سريعة نسبيا، وقابلة للتكرار، ورخيصة ولا تثير القضايا الأخلاقية 2 . والهدف من هذا العمل هو وصف بروتوكول السمية البيئية لتقييم استجابة البكتيريا البحرية فيبريو أنغيلاروم ( ليستونيلا أنغيلاروم، فيبريوناسي) عندما تتعرض للملوثات البيئية.
V. أنغيلاروم هو سالبة الجرام، قصيرة، على شكل منحنى قضيب بكتيريا (0.5 × 1.5 ميكرون) مع العلم القطبي. عادة ما توجد في المياه المالحة أو المالحة، هو هالوتوليرانت، مع ملوحة الأمثل من حوالي 20 ودرجة الحرارة المثلى بين 25 و 30 درجة مئوية 3 . وقد تم اختياره كنموذج للكائن الحي بسبب انتشاره وأدواره الإيكولوجية الهامة في المحيطفي جميع أنحاء العالم 4 . ومن المعروف أن بعض الأنماط المصلية لل V. أنغيلاروم تسبب فيبريوسيس في مجموعة متنوعة من أنواع الأسماك البحرية أو المالحة 5 ، 6 . لهذا، تتطلب بعض خطوات التجربة ممارسات ميكروبيولوجية قياسية، ولكن لا حاجة إلى معدات السلامة الخاصة أو الاحتياطات. يستخدم بروتوكول اختبار السمية المقترح الاستزراع الجرثومي ( أي القدرة على تكرار وتشكيل المستعمرات) كنقطة نهاية ويسمح بتحديد 50 لك، والتركيز الذي يؤدي إلى خفض بنسبة 50٪ من البكتيريا تكرار بنشاط وتشكيل المستعمرات، بعد تعرض لمدة 6 ساعات. في فيبريو ، كما هو الحال في الميكروبات الأخرى، وهذا التخفيض، والتي نشير عموما إلى الوفيات، يمكن أن يكون جزئيا بسبب الأفراد في المرحلة 7 قابلة للحياة ولكن غير قابلة للثقافة (فنك). في هذه الدراسة، طبقنا هذه الطريقة لقياس التأثيرات السامة للكبريتات النحاس (كوسو 4)، وهو سمية مرجعية.
وقد تم تطوير هذه الطريقة لتوفير اختبار مناسب يعتمد على الكائنات الحية الدقيقة لتقييم السمية البيئية للملوثات / المركبات الكيميائية، بما في ذلك الملوثات الناشئة مثل المواد النانوية. الجدة من هذا البروتوكول بالمقارنة مع الأساليب القائمة المستخدمة للكائنات الدقيقة يرتبط أساسا إلى وسط التعرض ونقطة النهاية. في الواقع، يتم التعرض في محلول ملحي، وتجنب أي تدخل محتمل من وسط النمو مع الملوثات التحقيق، والتي قد تؤثر على الاستجابة البيولوجية 8 . نقطة النهاية هي الحد من الاستزراع البكتيري، والتي يمكن مقارنتها بسهولة مع نقاط النهاية الحادة الأخرى المستخدمة في الفحص السمية البيئية في البيئات البحرية / المالحة، على أساس البقاء على قيد الحياة / الوفيات. وعلاوة على ذلك، يستخدم بروتوكول تقنية من السائل إلى لوحة الصغرى التهم، وتستخدم بالفعل على E. القولونية 9 ، والحد من أحجام وبالتالي فإن كفاءة التجريبية(راجع الخطوات 3.3 و 3.4 من البروتوكول لمزيد من التفاصيل).
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا العمل بيواساي جديد مع البكتيريا البحرية V. أنغيلاروم التي تم تطبيقها بنجاح لتقييم الآثار السامة لل كوسو 4 ، سمية مرجعية، مما يدل على علاقة جرعة والاستجابة واضحة. تم اختيار البكتيريا البحرية V. أنغيلاروم ككائن نموذجي لأنه هو هالوتوليرانت، في كل مكان، وممثل للنظم الإيكولوجية البحرية.
ويمكن إجراء الاختبار على نطاق واسع من قيم الملوحة (5-40) ويمكن استخدام المحاليل الملحية والماء البحري الطبيعي أو الطبيعي كوسيط التعرض، طالما أن الكائنات الحية الدقيقة يمكن البقاء على قيد الحياة بسهولة لمدة الاختبار بأكمله. وهذا يسمح بتحليل أنواع مختلفة من العينات، بما في ذلك البيئات الملوحة والبحرية.
لا حاجة إلى وسط النمو خلال مرحلة التعرض، وتجنب تدخله في الملوثات 8 وتأثيرها المحتمل على الاستجابة البيولوجية. ثه بروتوكول موثوق بها وسريعة وفعالة من حيث التكلفة، وسهلة نسبيا. إن إجراء التعداد الصغير من السائل إلى اللوحة 9 يعطي ميزة استخدام أحجام صغيرة (عينة)، على الرغم من أن هذا ينطوي على درجة عالية من الدقة والمتانة. نتائج التجارب الثلاث المستقلة ومكررات لكل معاملة تظهر التكرار عالية من هذه الطريقة. استخدام البكتيريا كنموذج بيولوجي، فضلا عن القدرة على التكيف من هذه التقنية، صالح الايكولوجية والبيئية لهذا الإجراء. القضايا الفنية الهامة الأخرى هي دقة في إعداد اللقاح البكتيري والعقم المطلوبة في بعض خطوات الإجراء.
الاختبار المقترح هو أسرع (6 ساعات) من المقايسات الايكولوجية البحرية الأخرى (24-96 ح) ولا يثير المشاكل الأخلاقية الناجمة عن استخدام الكائنات الحية الأعلى. وعلاوة على ذلك، تظهر البيانات عن القيمة السمية المرجعية لك 50 القيم مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها مع t الحادة على الأنواع البحرية الأخرى 10 ، 11 ، مما يدل على حساسية جيدة. ومن بين الاختبارات البيولوجية الجرثومية، فإن اختبار تثبيط التلألؤ V. فيسشيري هو الأكثر شيوعا وموحدا جيدا 12 . هذا بيواساي سريع جدا (15-30 دقيقة) وصالحة لاختبار عينات المرحلة الصلبة، ولكن يمكن أن تتأثر العينات الملونة والعكر، والتي تتداخل مع قياسات التلألؤ. الملوحة عامل مقيد في استخدام الاختبار المذكور أعلاه، مع 2٪ كلوريد الصوديوم المطلوبة 13 . على العكس من ذلك، فإن الاختبار المقترح هنا مع V. أنغيلاروم يعطي نتائج معقولة في مجموعة واسعة من قيم الملوحة، وليس له قيود فيما يتعلق العكر أو عينات ملونة، ويتطلب معدات أقل تكلفة مقارنة مع تحليل التلألؤ. مقارنة بين نتائج دراستنا وتلك المتوفرة في الأدب ل V. فيشيري 14 ،سس = "كريف"> 15 ، 16 يظهر مقارنة إيك 50 القيم، مما يدعم فعالية هذا الحيوي.
ويقيم هذا الاختبار الحيوي الحد من الاستزراع البكتيري، ويشار عموما إلى الوفيات، بدلا من معدل النمو السكاني أو تثبيط النشاط الأنزيمي، والتي تستخدم في الاختبارات المتاحة حاليا للكائنات الحية الدقيقة. ويتيح حساب ال لك 50 المقارنة مع المقايسات الحيوية الأخرى التي تطبق عادة على التقييم البيئي السمي للبيئات البحرية، التي غالبا ما يكون لها البقاء على قيد الحياة / الوفيات كنقطة نهاية. هناك حاجة ماسة إلى إجراء عملية معايرة مشتركة لتقييم / تأكيد موثوقية واستنساخ هذا الاختبار ودعم توحيده واستخدامه في البروتوكولات التنظيمية.
ويشير الاستخدام المتزايد للمواد النانوية وإطلاقها المحتمل في البيئة إلى الحاجة إلى تقييم المخاطر 17 . ومع ذلك، كلاسيبدو أن النهج السمية (البيئية) السمية لهذه الملوثات الناشئة لا تعطي نتائج معقولة ويمكن أن تتطلب بعض التعديلات 18 . خصائص هذا بيواساي جديدة تسمح لتطبيقه سهلة ومفيدة لتقييم سمية الجسيمات النانوية. في الواقع، فإن إمكانية إجراء الفحص في ملوحة مختلفة تعطي حسابات لسلوك الجسيمات النانوية تحت مختلف القوة الأيونية، متغير المعلمة البيئية التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على السمية 19 . وعلاوة على ذلك، لا يوصى باستخدام وسط النمو والمغذيات بشكل خاص في التقييمات السمية البيئية للجسيمات النانوية لأن المواد العضوية يمكن أن تسهل امتصاصها عن طريق زيادة الآثار السامة 20 أو يمكن أن يسبب التجميع، والحد من جزء بيوافايلابل وبالتالي سميتها 21 .
في الختام، بيواساي على فيبريو أنغيلاروم هو أبأداة مدمجة لتقييم المخاطر من الملوثات الكلاسيكية والناشئة، فضلا عن تقييم حالة البيئات البحرية والملوحة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا المشروع من خلال مشروع بحثي بعنوان "نانوبيوتيش أمبينت e سوتيوت": "البيئة النظيفة: البيئة والصحة" المشروع 2: البيئة، أدوات وأساليب الإيكولوجية السمية رصد الجسيمات النانوية " ) الممنوحة إلى لم من إقليم لاتسيو-كونسورزيو هيباتيا. وقد تم تمويل أر من منحة ما بعد الدكتوراه من جامعة تور فيرغاتا / ريجيون لازيو-كونسورزيو هيباتيا في إطار المشروع المذكور سابقا. وأتاح اتفاق مع جامعة إسبرا – تور فيرغاتا (N. 2015/52857) الاستخدام المتبادل للمرافق وتبادل الباحثين.
المؤلفون مدينون للأستاذة ماريا كريستينا ثالر، الملاك الحارس لجميع الأنشطة الميكروبية، لرفع الاهتمام بالعالم الميكروبي والمساعدة بقوة لتحسين أبحاثنا حول هذه المسألة. يعترف المؤلفون بكل سرور أندريا تورنامبي وإيريكا ماغاليتي للتعاون الثمين مع مختبر إسبرا من العوالق النباتية البيئة وعلم السموم البيئية.
Materials
| Vibrio anguillarum (strain AL 102, serotype O1) | Obtained from the laboratory collection of NOIFMA (Norway) | ||
| Tryptic Soy Agar | Liofilchem | 610052 | Dehydrated Culture Media |
| Tryptic Soy Broth growth medium | Liofilchem | 610053 | Dehydrated Culture Media |
| CuSO4 ·5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar Flow Hood | ESCO | ||
| Incubator | Fratelli Galli | Mod. 2100 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Benchmark Dose Software | US EPA | Benchmark Dose 2.4.0 | 2012 |
References
- Parvez, S., Venkataraman, C., Mukherji, S. A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals. Environm. Internat. 32 (2), 256-268 (2006).
- Rad, M., Shahsavani, D. Isolation and characterization of Vibrio (Listonella) anguillarum from catfish. Turkish J. Veter. Animal. 34 (4), 413-415 (2010).
- Thompson, F., Iida, T., Swings, J. Biodiversity of Vibrios. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 403-431 (2004).
- Austin, B., Austin, D. A. Vibrionaceae representatives: characteristics of the disease. Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish. 29-30, 108-115 (1999).
- Larsen, J. L., Mellergaard, S. Microbiological and hygienic problems in marine aquaculture: furunculosis and vibriosis in rainbow trout (Salmo gairdneri). L.). Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1, 29-31 (1981).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. J. Microbiol. 43 (1), 93-100 (2005).
- Hsieh, C. -. Y., Tsai, M. -. H., Ryan, D. K., Pancorbo, O. C. Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fisheri in the Microtox chronic toxicity test. Sci. Total Environ. 320, 37-50 (2004).
- Migliore, L., Rotini, A., Thaller, M. C. Low doses of Tetracycline trigger the E. coli growth: a case of hormetic response. Dose-Response. 11, 550-557 (2013).
- Adams, M. S., Stauber, J. L. Development of a whole-sediment toxicity test using a benthic marine microalga. Environm. Toxicol. Chem. 23 (8), 1957-1968 (2004).
- Manfra, L., et al. Ecotoxicity of diEthylene Glycol and risk assessment for marine environment. J. Hazard. Mat. 284, 130-135 (2015).
- . . Microtox® Acute Toxicity Solid-Phase Test. , 20 (1995).
- . Metodi analitici per le acque. Manuali e Linee Guida (Analytical methods for waters. Manual and Guidelines). Metodi Ecotossicologici (Ecotoxicological methods). 29 (3), 8030 (2003).
- Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. -. C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Heinlaan, M., Kurvet, I., Kahru, A. High throughput kinetic Vibrio fischeri bioluminescence inhibition assay for study of toxic effects of nanoparticles. Toxicol. In Vitro. 22 (5), 1412-1417 (2008).
- Bondarenko, O. M., et al. Multilaboratory evaluation of 15 bioassays for (eco) toxicity screening and hazard ranking of engineered nanomaterials: FP7 project NANOVALID. Nanotoxicology. 10 (9), 1229-1242 (2016).
- Matranga, V., Corsi, I. Toxic effects of engineered nanoparticles in the marine environment: model organisms and molecular approaches. Mar. Envir. Res. 76, 32-40 (2012).
- Corsi, I., et al. Common strategies and technologies for the ecosafety assessment and design of nanomaterials entering the marine environment. ACS NANO. 8 (10), 9694-9709 (2014).
- Handy, R. D., von der Kammer, F., Lead, J. R., Hassellöv, M., Owen, R., Crane, M. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles. Ecotoxicology. 17, 287-314 (2008).
- Kasemets, K., Suppi, S., Kunnis-Beres, K., Kahru, A. Toxicity of CuO nanoparticles to yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild-type and its nine isogenic single-gene deletion mutants. Chem. Res. Toxicol. 26, 356-367 (2013).
- Ivask, A., et al. Mechanisms of toxic action of Ag, ZnO and CuO nanoparticles to selected ecotoxicological test organisms and mammalian cells in vitro: A comparative review. Nanotoxicology. 8 (1), 57-71 (2013).
